| 查看: 10014 | 回复: 17 | |||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||||
小小米呐新虫 (小有名气)
|
[交流]
SDS-PAGE分离胶浓度如何选择已有9人参与
|
||||
| 各位最近在做SDS-PAGE实验，要分的蛋白分子量大概是2KD--40KD，应该选择多大的分离胶和夹层胶浓度呢？之前尝试过分离胶、夹层胶、浓缩胶分别是15%、10%、6%,可是跑胶时间居然是六七个小时，电压是从80V到200V，而且Marker看不到任何痕迹，急急急！！！！ |
回复此楼» 收录本帖的淘贴专辑推荐
 蛋白质生物学实验经验 | 糖蛋白专辑 |
» 猜你喜欢
阴阳离子交换剂！！！！
已经有3人回复
-
二苄基磷酰氯，磷酸接酚羟基，
已经有11人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有59人回复
-
二苄基磷酰氯，磷酰氯
已经有10人回复
-
酸酐或者羧酸酰氯化
已经有15人回复
-
酚羟基接入磷酸，磷酸酯化
已经有26人回复
-
土壤中可溶性有机碳种类
已经有1人回复
-
韩国海关检测食用植物油中的苯并芘用的是哪种方法？
已经有0人回复
-
现有pP43NMK质粒，想换了pHT43，或者其他芽孢杆菌过表达质粒
已经有5人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- SDS-PAGE制胶问题
已经有10人回复
- 求助！单体蛋白在SDS-PAGE中出现了倍数关系的大条带！
已经有8人回复
- 40KD,39KD蛋白，SDS-PAGE如何分离，胶浓度？
已经有7人回复
- 8KDa蛋白在SDS-PAGE电泳时分离胶的浓度该选择多大？
已经有7人回复
- 为什么我做的SDS-PAGE分离胶凝固后上半部分稀下半部分浓？谢谢
已经有14人回复
- 为什么SDS-PAGE胶在做胶的时候会出现不均匀的条纹？
已经有17人回复
- SDS-PAGE电泳，什么原因导致这种。有图有真相。谢谢各位给出宝贵意见！
已经有19人回复
- SDS-PAGE跑成这样是什么原因？
已经有10人回复
- 就要被蛋白质电泳（SDS-PAGE）灭了，有图有真相，望高手指点
已经有28人回复
- SDS-PAGE凝胶电泳求教
已经有14人回复
- SDS-PAGE蛋白电泳
已经有24人回复
- 谁给我讲一下SDS-PAGE浓缩胶的作用
已经有6人回复
- SDS-page 分离胶不凝固
已经有19人回复
- SDS-PAGE 胶的孔径有多大啊？ 有木有人了解？木有查到。。。
已经有8人回复
- WB结果不理想，呼唤帮助
已经有20人回复
- 如何选择SDS-PAGE凝胶浓度？
已经有9人回复
- 【求助/交流】SDS-PAGE电泳分离胶和浓缩胶浓度问题
已经有11人回复
- 【求助】请问蛋白电泳的原料应该怎么处理？
已经有7人回复
- 【求助/交流】SDS-PAGE电泳 跑的特别慢
已经有23人回复
- 【求助/交流】SDS-PAGE电泳的电流怎么设啊？
已经有13人回复
- 【分享】个人整理 Western Blot(转）
已经有73人回复
myprayer
专家顾问 (著名写手)
- MolEPI: 12
- 应助: 81 (初中生)
- 贵宾: 2.822
- 金币: 32406.9
- 散金: 1696
- 红花: 158
- 沙发: 3
- 帖子: 2275
- 在线: 822.5小时
- 虫号: 1759711
- 注册: 2012-04-16
- 专业: 生物力学与生物流变学
- 管辖: 生物医药区
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-07-13 18:59:05
gyesang: 金币+3, 热心虫子，很全面！ 2013-07-14 02:38:22
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-07-13 18:59:05
gyesang: 金币+3, 热心虫子，很全面！ 2013-07-14 02:38:22
|
楼主，之前类似的帖子已经有了，可以简单的搜索一下，我之前给一个虫子应助过该问题： 觉得主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。 处理办法：电泳槽正确装配即可。 在电泳前移除胶盒底部的封条；确认缓冲液没过加样孔；检查buffer core上导线连接 常规出现的问题如下以及注意事项如下： 注意事项： 1、 固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板。 2、 凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡。 3、 水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡。 4、 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。 5、 样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。 6、 要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果。 7、 注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下沉时会发生扩散。 8、 为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样. 9、 剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分。 凝胶不均匀冷却，中间冷却不好， 可能装置不合适， 凝胶和玻璃挡板底有bubble，或者俩遍聚合不完全，样品溶解不好，样品中含有不溶性颗粒， 电极不平衡或者加样位置偏了，加样量过多。蛋白质在十二烷基硫酸钠（SDS）和巯基乙醇的作用下，分子中的二硫键还原，氢键等打开，形成按1.4gSDS/1g蛋白质比例的SDS-蛋白质多肽复合物，该复合物带负电，故可在聚丙烯酰胺凝胶电泳中向正极迁移，且主要由于凝胶的分子筛作用，迁移速率与蛋白质的分子量大小有关，因此可以浓缩和分离蛋白质多肽。 聚丙烯酰凝胶电泳分离蛋白质多数采用一种不连续的缓冲系统，主要分为较低浓度的成层胶和较高浓度的分离胶，配制凝胶的缓冲液，其pH值和离子强度也相应不同，故电泳时，样品中的SDS-多肽复合物沿移动的界面移动，在分离胶表面形成了一个极薄的层面，大大浓缩了样品的体积，即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩效应。 [试剂] 1、30%凝胶贮备液：称取29g 丙烯酰胺（Acr）和1g 甲叉-双丙烯酰胺（Bis），加蒸馏水至100ml，滤纸过滤贮存。 2、10% SDS：称取SDS 10g 加蒸馏水至100ml。 3、10%过硫酸胺（AP） 4、N，N，N’，N’四甲基乙二胺（TEMED） 5、5×电泳缓冲液：于900ml蒸馏水中分别加入15.1g Tris、94g甘氨酸、5g SDS，混匀后加蒸馏水至1 000ml。 6、1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)和1.0mol/L Tris-HCl(pH6.8) 7、电泳加样缓冲液 10mmol/LpH6.8 Tris 200mmol/LDTT 4%SDS 0.2% 溴酚兰 20% 甘油 8.正丁醇 [操作步骤] 1.配制分离胶浓度8%、体积15ml H2O 6.9ml 30%凝胶贮备液 4.0ml 1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8) 3.8ml 10%SDS 0.15ml 10%过硫酸胺 0.15ml TEMED 0.01ml 2.一旦加入TEMED，混匀后立即小心地将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，为成层胶留有足够空间。用毛细管轻轻在其顶层加入几毫升正丁醇，以阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。 3.聚合完成之后，倒掉覆盖液体，用去离子水洗凝胶上部数次，尽可能用吸水纸吸干顶端的残存液体。 4.配制5%成层胶5ml，插入梳子，小心避免混入气泡，垂直放置室温下。H2O 3.4ml 30%凝胶贮备液 0.83ml 1.0mol/Ltris-HCl(pH6.8) 0.63ml 10%SDS 0.05ml 10%过硫酸胺 0.05ml TEMED 0.01ml 5.在成层胶聚合时，将样品与加样缓冲液混匀，100℃加热3min。 6.成层胶聚合完成后，用去离子水冲洗梳孔以除去未聚合的丙烯酰胺，将凝胶放入电泳槽上。 7.加样 8.电泳：开始时电压为8V/cm凝胶，染料进入分离胶后，将电压增加到15V/cm凝胶，继续电泳直到染料抵达分离胶底部，断开电源。 9.取下凝胶，固定、染色或进行Western blot分析。 |
2楼2013-07-13 18:49:27
5