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SDS-PAGE分离胶浓度如何选择已有9人参与
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| 各位最近在做SDS-PAGE实验，要分的蛋白分子量大概是2KD--40KD，应该选择多大的分离胶和夹层胶浓度呢？之前尝试过分离胶、夹层胶、浓缩胶分别是15%、10%、6%,可是跑胶时间居然是六七个小时，电压是从80V到200V，而且Marker看不到任何痕迹，急急急！！！！ |
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 蛋白质生物学实验经验 | 糖蛋白专辑 |
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楼主，之前类似的帖子已经有了，可以简单的搜索一下，我之前给一个虫子应助过该问题： 觉得主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。 处理办法：电泳槽正确装配即可。 在电泳前移除胶盒底部的封条；确认缓冲液没过加样孔；检查buffer core上导线连接 常规出现的问题如下以及注意事项如下： 注意事项： 1、 固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板。 2、 凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡。 3、 水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡。 4、 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。 5、 样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。 6、 要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果。 7、 注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下沉时会发生扩散。 8、 为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样. 9、 剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分。 凝胶不均匀冷却，中间冷却不好， 可能装置不合适， 凝胶和玻璃挡板底有bubble，或者俩遍聚合不完全，样品溶解不好，样品中含有不溶性颗粒， 电极不平衡或者加样位置偏了，加样量过多。蛋白质在十二烷基硫酸钠（SDS）和巯基乙醇的作用下，分子中的二硫键还原，氢键等打开，形成按1.4gSDS/1g蛋白质比例的SDS-蛋白质多肽复合物，该复合物带负电，故可在聚丙烯酰胺凝胶电泳中向正极迁移，且主要由于凝胶的分子筛作用，迁移速率与蛋白质的分子量大小有关，因此可以浓缩和分离蛋白质多肽。 聚丙烯酰凝胶电泳分离蛋白质多数采用一种不连续的缓冲系统，主要分为较低浓度的成层胶和较高浓度的分离胶，配制凝胶的缓冲液，其pH值和离子强度也相应不同，故电泳时，样品中的SDS-多肽复合物沿移动的界面移动，在分离胶表面形成了一个极薄的层面，大大浓缩了样品的体积，即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩效应。 [试剂] 1、30%凝胶贮备液：称取29g 丙烯酰胺（Acr）和1g 甲叉-双丙烯酰胺（Bis），加蒸馏水至100ml，滤纸过滤贮存。 2、10% SDS：称取SDS 10g 加蒸馏水至100ml。 3、10%过硫酸胺（AP） 4、N，N，N’，N’四甲基乙二胺（TEMED） 5、5×电泳缓冲液：于900ml蒸馏水中分别加入15.1g Tris、94g甘氨酸、5g SDS，混匀后加蒸馏水至1 000ml。 6、1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)和1.0mol/L Tris-HCl(pH6.8) 7、电泳加样缓冲液 10mmol/LpH6.8 Tris 200mmol/LDTT 4%SDS 0.2% 溴酚兰 20% 甘油 8.正丁醇 [操作步骤] 1.配制分离胶浓度8%、体积15ml H2O 6.9ml 30%凝胶贮备液 4.0ml 1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8) 3.8ml 10%SDS 0.15ml 10%过硫酸胺 0.15ml TEMED 0.01ml 2.一旦加入TEMED，混匀后立即小心地将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，为成层胶留有足够空间。用毛细管轻轻在其顶层加入几毫升正丁醇，以阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。 3.聚合完成之后，倒掉覆盖液体，用去离子水洗凝胶上部数次，尽可能用吸水纸吸干顶端的残存液体。 4.配制5%成层胶5ml，插入梳子，小心避免混入气泡，垂直放置室温下。H2O 3.4ml 30%凝胶贮备液 0.83ml 1.0mol/Ltris-HCl(pH6.8) 0.63ml 10%SDS 0.05ml 10%过硫酸胺 0.05ml TEMED 0.01ml 5.在成层胶聚合时，将样品与加样缓冲液混匀，100℃加热3min。 6.成层胶聚合完成后，用去离子水冲洗梳孔以除去未聚合的丙烯酰胺，将凝胶放入电泳槽上。 7.加样 8.电泳：开始时电压为8V/cm凝胶，染料进入分离胶后，将电压增加到15V/cm凝胶，继续电泳直到染料抵达分离胶底部，断开电源。 9.取下凝胶，固定、染色或进行Western blot分析。 |
2楼2013-07-13 18:49:27
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建议改进措施: 1.可以适当进一步地拉开浓缩胶和分离胶之间的pH值，比如浓缩胶为pH=6.6，分离胶为pH=8.9。 2.可以考虑加高电泳时，浓缩胶的电压为90-100 V，分离胶的电压到120V-200V，；浓缩胶和分离胶有时候可能都设成150 V也能电泳成功。 3.使用全新配置的缓冲溶液。 4.适当该种胶浓度下使用分离效果明显的Marker。 5.保持各种蛋白质样品和Marker在上样前能够充分溶解，上样前最好离心一下，实在溶解不掉的颗粒就去掉。 6.适当调整聚丙烯酰胺的凝胶浓度。 7. 聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。 8.样品缓冲溶液用：Tris-HCl缓冲溶液，电泳缓冲溶液用:Tris –Gly缓冲溶液。 附录： 1.样品处理（充分溶解样品）：根据样品分离目的不同，在上样前对样品进行的溶解处理主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。 （1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT(或Beta巯基乙醇)后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。 （2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100μl样品缓冲液中10μl 20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。 （3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。 2.在SDS-PAGE不连续电泳中，pH对整个反应体系的影响是至关重要的。制胶缓冲液使用的是Tris-HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.8，分离胶pH8.8;而电泳缓冲液使用的Tris-甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低;而Cl离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH(>8.8)的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素，即适当进一步地拉开浓缩胶和分离胶之间的pH值的差值。 3. 聚丙烯酰胺凝胶浓度与蛋白质分离范围的关系： 聚丙烯酰胺凝胶浓度/% 蛋白质分离范围/kd 5 36—200 7.5 24—200 10 14—200 12.5 14—100 15 14—60 浓缩胶浓度低；分离胶浓度高于浓缩胶，一般不小于5%。 |
6楼2013-07-14 01:19:51
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更正：我的7楼的贴有错！不好意思！ 没有注意到你的蛋白质有2KD的，我在6楼的改进措施对于对于分子量低于3KD的蛋白质的电泳没有用，但是对于高于3KD的蛋白质的电泳有用。而且7楼其他地方还有其他错！写晕了。我又看了一下楼主的贴，你的分离胶浓度太小了（原帖说是大了）吧，聚丙烯酰胺凝胶浓度15% （上贴误写为5%）适用分离 14—60kd 的蛋白质，大概用聚丙烯酰胺凝胶浓度30%才行，这样就要用聚丙烯酰胺凝胶梯度凝胶电泳。凝胶的梯度一般是3%-30%，分离范围是10—200kd。 2KD的蛋白质必须要用Tricine胶系统，上面说的改进对于分子量低于3KD的蛋白质的电泳没有用，但是对于高于3KD的蛋白质的电泳有用。 以上材料的主要参考文献是： 吕宪禹 主编，蛋白质纯化实验方案与应用，化学工业出版社，2010，第13章。 |
8楼2013-07-14 01:47:15
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9楼2013-07-14 02:00:44
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