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hyc_charles

金虫 (小有名气)

[求助] 双酶切和PCR问题,求大神 已有1人参与

大家好,我做的是大麦总DNA的AFLP分子标记,第一步是双酶切,酶用的是MseI和EcoRI,体系MseI 1 μL,EcoRI 1 μL,模板500 ng,EcoRI Buffer 5 μL,BSA 0.5 μL,用ddH2O补足50μL,酶切产物呈smear状,但是非常的淡,能不能给解释一下呢,谢谢了!!

另外,接下来进行连接,预扩增,选择性扩增,选扩产物进行1%琼脂糖电泳,呈大片段的smear状,这是为什么啊,还有胶孔里怎么有东西残留呢,选扩之前跑电泳孔里没东西的。。。。。
双酶切和PCR问题,求大神
酶切产物.jpg


双酶切和PCR问题,求大神-1
二扩产物.jpg
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幽魂银龙

铜虫 (初入文坛)

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感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-08-30 16:53:15
你查过这两个限制酶的buffer一样吗?然后你把你的质粒和你酶切完的一起跑电泳看看
2楼2013-07-12 20:15:22
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hyc_charles

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 幽魂银龙 at 2013-07-12 20:15:22
你查过这两个限制酶的buffer一样吗?然后你把你的质粒和你酶切完的一起跑电泳看看

谢谢,我做的是总DNA,不是质粒,buffer用EcoRI的buffer,这个我是查过的,没有问题
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3楼2013-07-12 20:29:09
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匿名

用户注销 (著名写手)


myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-08-30 16:53:25
本帖仅楼主可见
4楼2013-07-13 23:39:12
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hyc_charles

金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by basler at 2013-07-13 23:39:12
我觉得你应该考虑一下酶切是否成功,图上感觉没有看到酶切产物,只有你的总DNA

谢谢!那个酶切产物非常淡…请问有什么好办法确定酶切没问题吗,我们一般就是跑琼脂糖看一下~

[ 发自小木虫客户端 ]
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5楼2013-07-14 08:14:52
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肃清华书

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-08-30 16:53:33
总DNA的反应速率应该是比较慢,或者说你的底物量有点少
6楼2013-07-14 08:45:07
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hyc_charles

金虫 (小有名气)

没有人会嘛,二扩产物为什么从头到尾的弥散!!!我已经卡在这里一个月了,真是要疯了- -
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7楼2013-07-15 20:35:41
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xiaohaixie

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

没看见酶切下来的片段啊,是不是没切开
Thehardyouwork,theluckyyouwill.年轻就要多吃苦
8楼2013-07-17 10:10:45
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懒洋洋羊吃草

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-08-30 16:53:44
BSA是不是稀释10倍啊 ,那不是加5ul吗
休近小阑干,夕阳无限山
9楼2013-07-30 11:11:43
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susan小水

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-08-30 16:53:52
加油了!我做的是RFLP,之前遇到的问题是dna量太少  不知你是否是
原谅我一生,放纵不羁爱自由
10楼2013-08-14 20:56:42
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