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lb3522922

铜虫 (小有名气)

[求助] 重叠延伸PCR

最近在做重叠延伸PCR,先分别扩增两个片段,回收后做梯度PCR,然后取一定量的产物做普通PCR得到目的基因的全长,因为条带特异,所以就直接回收产物(PCR产物回收试剂盒没有问题),没有切胶回收,我做了50微升的体系5管,回收到一起,结果浓度特别低,电泳条带很弱,不知道这是哪里出了问题。所以想请教各位,帮忙分析一下原因,不胜感激!
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JICK159

木虫 (正式写手)

不是很懂,来学习学习
2楼2013-06-09 11:50:28
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liygmail

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-06-09 21:57:34
做第二步pcr时,做模板的两个片段量提高一些,同时保证两个片段的摩尔比1:1
3楼2013-06-09 14:18:32
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独立寒秋

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-06-10 16:55:25
第二步扩增时产物特异,产物浓度怎么样,最好切胶吧,反正你也扩了5管,不然会有第一步扩增产物的残留在体系中。第二步回收后是不是你回收洗脱的时候洗脱液用多了,你就把5管切胶回收,过同一个柱子,最后用个40-50ul洗脱,浓度应该不会低吧
4楼2013-06-10 12:03:20
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