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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 重叠延伸PCR
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lb3522922

铜虫 (小有名气)

[求助] 重叠延伸PCR

最近在做重叠延伸PCR，先分别扩增两个片段，回收后做梯度PCR，然后取一定量的产物做普通PCR得到目的基因的全长，因为条带特异，所以就直接回收产物（PCR产物回收试剂盒没有问题），没有切胶回收，我做了50微升的体系5管，回收到一起，结果浓度特别低，电泳条带很弱，不知道这是哪里出了问题。所以想请教各位，帮忙分析一下原因，不胜感激！
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1楼 2013-06-09 11:48:39
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JICK159

木虫 (正式写手)
不是很懂，来学习学习
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2楼2013-06-09 11:50:28
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liygmail

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-06-09 21:57:34
做第二步pcr时，做模板的两个片段量提高一些，同时保证两个片段的摩尔比1:1
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3楼2013-06-09 14:18:32
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独立寒秋

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-06-10 16:55:25
第二步扩增时产物特异，产物浓度怎么样，最好切胶吧，反正你也扩了5管，不然会有第一步扩增产物的残留在体系中。第二步回收后是不是你回收洗脱的时候洗脱液用多了，你就把5管切胶回收，过同一个柱子，最后用个40-50ul洗脱，浓度应该不会低吧
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4楼2013-06-10 12:03:20
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