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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达后蛋白跑SDS-PAGE细节问题
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xjtu0025

新虫 (小有名气)

[求助] 原核表达后蛋白跑SDS-PAGE细节问题

请问我构建好了一个原核表达载体，想表达一下蛋白试试跑SDS-PAGE。有几个细节不太懂。
1、我用IPTG诱导以后，应该取多少量的菌来超声破碎呢？表达载体是pET-32a，蛋白大小20.1KD,和18.6KD。
2、我有问到用50ml超声破碎的，然后取上清液的话我要怎么浓缩蛋白呢？
3、我的目的只是要跑出合适大小的条带然后做个western，用HISTAG的抗体。。所以空载和我的载体肯定都会有抗原抗体反应，后来的纯化还不考虑。这样我可不可以就取10ml菌液离心。然后加PBS超声破碎然后直接上样跑？
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1楼 2013-05-27 16:36:49
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xjtu0025

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by qiulongxiang at 2013-05-27 18:58:14
1、我用IPTG诱导以后，应该取多少量的菌来超声破碎呢？表达载体是pET-32a，蛋白大小20.1KD,和18.6KD。
多多益善
2、我有问到用50ml超声破碎的，然后取上清液的话我要怎么浓缩蛋白呢？
可以用半透膜，用庶糖把水份 ...

谢谢啊。。。我今天又问了做过这个的同学说，如果我是跑胶检测一下蛋白，就不用超声了。取一点菌体直接加loading buffer煮沸就可以上样了。这样的话多少菌体比较合适呢。我现在设置的是摇瓶过夜后，加iptg，一小时以后取样。多少g菌体比较合适？
空载和我加了片段的载体差别是80个氨基酸。。这样的话会不会看不出差别？
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3楼2013-05-27 22:33:12
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qiulongxiang

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 热心的虫虫 2013-05-28 08:18:44
1、我用IPTG诱导以后，应该取多少量的菌来超声破碎呢？表达载体是pET-32a，蛋白大小20.1KD,和18.6KD。
多多益善
2、我有问到用50ml超声破碎的，然后取上清液的话我要怎么浓缩蛋白呢？
可以用半透膜，用庶糖把水份吸收
3、我的目的只是要跑出合适大小的条带然后做个western，用HISTAG的抗体。。所以空载和我的载体肯定都会有抗原抗体反应，后来的纯化还不考虑。这样我可不可以就取10ml菌液离心。然后加PBS超声破碎然后直接上样跑？
空载和载体跑出来要有区别才行
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2楼2013-05-27 18:58:14
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
3楼: Originally posted by xjtu0025 at 2013-05-27 22:33:12
谢谢啊。。。我今天又问了做过这个的同学说，如果我是跑胶检测一下蛋白，就不用超声了。取一点菌体直接加loading buffer煮沸就可以上样了。这样的话多少菌体比较合适呢。我现在设置的是摇瓶过夜后，加iptg，一小时 ...

超声做的是可溶蛋白，如果你只检测是否诱导出来，可以做全菌蛋白，就是按照你的同学说的那样用loading buffer就可以了。1ml的菌液就够你跑很多胶的了。你现在检测的是蛋白，不是DNA，空载体不会有你的目的蛋白吧。至于最后表达的蛋白多大，要看你克隆时酶切位点的选取。在pET32a上带有很多标签的。
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4楼2013-05-28 08:51:28
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