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kikiwitch

新虫 (初入文坛)

[交流] SDS-PAGE跑膜蛋白为什么会这样 已有3人参与

第一次跑膜蛋白，用的是TRITON 来溶解的，用的是10%的胶，为什么感觉大部分蛋白都挤在上部分了。

另外，因为我要检测的是cytochrome，细胞色素在菌体的的表达，所以用专门的方法染了一下细胞色素，见下图，从左到右2，4两条是我的sample，其他是control（没有转质粒进去的野生菌株），感觉确实蓝色条带加深了，但都挤在了胶最上方，不知道为什么。

新手发帖，没有金币悬赏，实在抱歉啊。
SDS-PAGE跑膜蛋白为什么会这样
SDS.jpg


SDS-PAGE跑膜蛋白为什么会这样-1
heme staining.jpg

[ Last edited by kikiwitch on 2013-5-23 at 16:28 ]
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1楼 2013-05-23 16:27:03
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kikiwitch

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by edoz1986 at 2013-05-23 17:12:01
你的膜蛋白应该没有提取出来，还是在细胞膜上吧！在对膜蛋白进行纯化和纯化的时候，要用去污剂将蛋白与细胞膜进行分离，并在去污剂溶解的状态下进行纯化，纯化后膜蛋除去白去污剂再进行重构。你用的triton应该不能（ ...

但是我查的文献里有这么说的：
(DDM), Triton X-100 (TX-100) and Triton X-114 (TX-114) are commonly used for solubilization of membranes when keeping protein structure and function intact。。。
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5楼2013-05-23 17:44:51
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edoz1986

新虫 (小有名气)
★ ★
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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-23 18:47:08
你的膜蛋白应该没有提取出来，还是在细胞膜上吧！在对膜蛋白进行纯化和纯化的时候，要用去污剂将蛋白与细胞膜进行分离，并在去污剂溶解的状态下进行纯化，纯化后膜蛋除去白去污剂再进行重构。你用的triton应该不能（或很少）提取溶解吧！
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2楼2013-05-23 17:12:01
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edoz1986

新虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-23 18:48:02
引用回帖:
2楼: Originally posted by edoz1986 at 2013-05-23 17:12:01
你的膜蛋白应该没有提取出来，还是在细胞膜上吧！在对膜蛋白进行纯化和纯化的时候，要用去污剂将蛋白与细胞膜进行分离，并在去污剂溶解的状态下进行纯化，纯化后膜蛋除去白去污剂再进行重构。你用的triton应该不能（ ...

可以用ddm来溶解膜蛋白，你溶解的时候破碎了吗？
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3楼2013-05-23 17:25:33
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kikiwitch

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by edoz1986 at 2013-05-23 17:25:33
可以用ddm来溶解膜蛋白，你溶解的时候破碎了吗？...

是的，我先超声将细胞破碎后，用ultracentrifugation方法将上清与膜分开，之后用
5% wt/vol Triton X-100, 50 mM Hepes pH 7.4, 200 mM NaCl 溶液进行溶解。
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4楼2013-05-23 17:38:42
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