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安小安4302铁虫 (正式写手)
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[求助]
求镍柱子纯化表达蛋白的具体步骤，注意事项！！！
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如题 本科大三第一次做，老师也不了解，请教了别的老师，但具体还是要查，求有经验的虫虫给讲讲！！ |
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4楼2013-05-21 14:36:17
2楼2013-05-21 08:09:16
xbl3688
银虫 (正式写手)
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- 专业: 生物大分子结构与功能
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
安小安4302: 金币+3, 谢谢 2013-05-21 18:52:00
感谢参与，应助指数 +1
安小安4302: 金币+3, 谢谢 2013-05-21 18:52:00
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1、 过柱前的注意事项： a、 样品必须澄清、无颗粒物，否则会堵塞柱子、缩短其使用寿命； b、 包含体洗涤的最后一步及溶解时所用的Buffer中不能含EDTA、DTT、2ME； c、 确保样品及Binding Buffer中有适量的NaCl，以防止杂离子与Ni离子竞争； 2、 过Ni柱的操作步骤： a、用去离子水洗涤，洗去20％的乙醇、除尽基质中的空气，并能防止下一步中Ni离子沉淀； b、5×柱体积的Charge Buffer（50mM NiSO4）充电； c、5×柱体积的去离子水洗涤，去游离的Ni离子； d、 10×柱体积的Binding Buffer（20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,5mM咪唑，pH8.0）平衡； e、 上样（手工上样，样品体积应根据目的蛋白的浓度来确定）； f、 20×柱体积的Washing Buffer（20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,20-50mM咪唑，pH8.0）洗涤，至无蛋白检出，收集流出液； g、 Elution Buffer（20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,500－1000mM咪唑，pH8.0）洗脱，每次1ml，应呈现正态分布（两边稀，中间浓）； h、 10×柱体积的Binding Buffer洗涤。此时，即可用于纯化同种蛋白，很少需要重新充电。 注：同种蛋白纯化5～10次后，应进行strip和re-charge。 3、柱的清洗与保存： a、去Ni离子：a、5×柱体积的Strip Buffer（20mMTris-HCl,0.5M NaCl,50mM EDTA，pH7.4）洗涤；b、10×柱体积的去离子水洗涤。 b、去沉淀的蛋白质：a、5×柱体积的0.5M NaOH装满柱子，静置0.5～2hr；b、去离子水洗涤，至流出液的pH值为7。 c、保存：20％乙醇洗涤，再加20％乙醇保存于4℃。 |
5楼2013-05-21 15:23:54
6楼2015-05-04 16:04:14
