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新虫 (小有名气)

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[求助] 包涵体复性试剂盒

最近在大肠杆菌中表达目的基因，优化了好多次，可表达的几乎都是包涵体，于是我决定包涵体复性，请问大家用过什么包涵体复性试剂盒？我看网上有卖生工的，不知道好用不？有包涵体复性的步骤吗？感激不尽！

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1楼 2013-05-18 11:35:09

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新虫 (小有名气)

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引用回帖:

2楼: Originally posted by 不转录的DNA at 2013-05-18 12:48:56
楼主，你好

我没用过什么其他家生产的蛋白 renaturation的试剂盒，我的蛋白refolding buffer都是我足迹配置的！

我给你回答最后一个问题吧！
蛋白复性是一门比较难的学问，很难讲清楚！如果要长篇大论，我最 ...

非常感谢您给我的宝贵经验，我决定尝试一下

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3楼2013-05-18 14:35:07

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不转录的DNA

金虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

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appletree-: 金币+2, ★★★★★最佳答案 2013-05-18 14:34:06
myprayer: 金币+2, MolEPI+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-18 16:00:59

楼主，你好

我没用过什么其他家生产的蛋白 renaturation的试剂盒，我的蛋白refolding buffer都是我足迹配置的！

我给你回答最后一个问题吧！
蛋白复性是一门比较难的学问，很难讲清楚！如果要长篇大论，我最起码可以写个8000字的综述····每个蛋白他的renaturation方法是不同的！我暂时还没有发现一个万能的buffer来用于蛋白的复性！普通蛋白还好点，cytokines就比较难了！好了，长话短说，简单介绍下吧：
1. 在你复性之前，你要先了解你蛋白的物理性质和生化性质，可以通过专门软件和专业网站，例如DNAman 和NCBI。
2.根据你的protein pI值，来选择合适的缓冲体系，Tris，PBS，或者HEPES等
3.可以通过添加一些盐来增加蛋白的溶解性，例如NaCl；也可以通过添加一些抑制剂来增强蛋白的稳定性，如EDTA,PMSF等
4.适当的添加Arg可以又利于蛋白的refolding，最好在0.4~0.8之间选择，这期间复性的protein是有活性的。
5.也可以通过添加低浓度的变性剂来提高蛋白的复性，Urea<2M，Gin-Hcl<0.8M
6.如果你的蛋白中含有二硫键，要加入氧化还原系统来refolding！如GSH和GSSG，半胱氨酸和胱氨酸等，一般比例为10:1.
7.去垢剂的加入，有利于膜蛋白的refolding，关键在于去垢剂种类的选择：离子型还是非离子型的呢？
8. 复性时间的长短。一般变性剂在搅拌的情况下3~4h就能透析掉，如果在这个时候不沉淀，你就放心大胆的复性吧！最好复性一天（24h）！当然不排除意外！！

9.复性最好是逐步降低你的变性剂浓度，可以更好与你的renaturation，避免蛋白发生aggregation，从而沉淀！
10.在你将你的protein 复性之前，先要做个复性小试！取少量的蛋白复性试试，离心观察是否有沉淀！没有，你就可以放心大胆的做了！不排除小试不沉，大量的就沉。这种情况很少！希望你不那么倒霉！！