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不转录的DNA

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
appletree-: 金币+2, ★★★★★最佳答案 2013-05-18 14:34:06
myprayer: 金币+2, MolEPI+1, 赠人玫瑰手有余香,感谢你的慷慨解囊,期待你的精彩。 2013-05-18 16:00:59
楼主,你好

我没用过什么其他家生产的蛋白 renaturation的试剂盒,我的蛋白refolding buffer都是我足迹配置的!

我给你回答最后一个问题吧!
蛋白复性是一门比较难的学问,很难讲清楚!如果要长篇大论,我最起码可以写个8000字的综述····每个蛋白他的renaturation方法是不同的!我暂时还没有发现一个万能的buffer来用于蛋白的复性!普通蛋白还好点,cytokines就比较难了!好了,长话短说,简单介绍下吧:
1. 在你复性之前,你要先了解你蛋白的物理性质和生化性质,可以通过专门软件和专业网站,例如DNAman 和NCBI。
2.根据你的protein pI值,来选择合适的缓冲体系,Tris,PBS,或者HEPES等
3.可以通过添加一些盐来增加蛋白的溶解性,例如NaCl;也可以通过添加一些抑制剂来增强蛋白的稳定性,如EDTA,PMSF等
4.适当的添加Arg可以又利于蛋白的refolding,最好在0.4~0.8之间选择,这期间复性的protein是有活性的。
5.也可以通过添加低浓度的变性剂来提高蛋白的复性,Urea<2M,Gin-Hcl<0.8M
6.如果你的蛋白中含有二硫键,要加入氧化还原系统来refolding!如GSH和GSSG,半胱氨酸和胱氨酸等,一般比例为10:1.
7.去垢剂的加入,有利于膜蛋白的refolding,关键在于去垢剂种类的选择:离子型还是非离子型的呢?
8. 复性时间的长短。一般变性剂在搅拌的情况下3~4h就能透析掉,如果在这个时候不沉淀,你就放心大胆的复性吧!最好复性一天(24h)!当然不排除意外!!
9.复性最好是逐步降低你的变性剂浓度,可以更好与你的renaturation,避免蛋白发生aggregation,从而沉淀!
10.在你将你的protein 复性之前,先要做个复性小试!取少量的蛋白复性试试,离心观察是否有沉淀!没有,你就可以放心大胆的做了!不排除小试不沉,大量的就沉。这种情况很少!希望你不那么倒霉!!

好吧,就这么多吧!我去吃饭了!都大了快一个小时了!
长得比我英俊的,没我有才华!有才华的,没我长得俊!
2楼2013-05-18 12:48:56
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