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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 如何去除RNA提取过程中的蛋白质污染
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含羞草liu

新虫 (小有名气)

[求助] 如何去除RNA提取过程中的蛋白质污染

大家好！我目前正在构建cDNA文库，需要高质量的RNA。提取的材料是杨树叶片，最先我是用Trizol 提取的，提取到的RNA对OD值检测，发现OD260/OD280的范围在1.8~2.0之间，但电泳检测时加样孔总会发亮，也就是会有蛋白质的污染，直接用此法提取的RNA构建文库时总是很不理想。后来，我在takara 购买了RNAiso 试剂配合Fruit-mate试剂进行提取（这两种试剂是针对多糖多酚植物材料的），提取后检测，OD260/OD280的范围在1.8~2.0之间，但电泳时加样孔也会发亮，此法也不能有效的去除蛋白质。之后，我对Trizol提取后的RNA进行LiCL沉淀，配制5M LiCL沉淀液（配制方法为：称取LiCL 42.4g，Tris 0.4846g，EDTA 0.5846g溶于150ml DEPC处理水中，用5N NaOH 高PH 为7.4，之后DEPC处理水定容到200ml，高压灭菌），等量加入提取后的RNA中，-80度静置两小时，拿出后4度，14000rpm离心20min， 弃上清，可看到半透明状的沉淀。用预冷的75%乙醇清洗沉淀一次，7500rpm 离心5min，发现沉淀变成乳白色，加DEPC处理水，发现此沉淀很难溶解（已室温静置约10min，不溶，进行漩涡振荡，也不溶），随后，直接用此未完全溶解的RNA提取样进行检测，发现OD260/OD280大于1.8，有的甚至在2.0以上 ，但制胶电泳检测，加样孔仍会发亮，蛋白质仍旧没有除尽。

对于此文库构建，我已进行半年多，仍旧没有进展，问题总是出现在RNA的提取上。究竟要怎样才能除尽RNA中的蛋白质呢？请高手帮忙，感激不尽！！！
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努力，奋斗，拼搏。。。
1楼 2013-05-16 09:43:14
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

hyphen007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

请大家继续发言，说说呗，我现在也要做一个全长cDNA文库，正纠结那个kit呢，咋样又省钱又效果好呢
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9楼2013-07-10 17:03:03
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普通回帖

德国工兵铲

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
个人建议吸取上清的时候小心点，吸取少点。
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2楼2013-05-16 10:09:21
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含羞草liu

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 德国工兵铲 at 2013-05-16 10:09:21
个人建议吸取上清的时候小心点，吸取少点。

Trizol 提取时，我在吸取上清时已经很小心了，而且加氯仿分层两次，仍避免不了蛋白的污染。。。
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努力，奋斗，拼搏。。。
3楼2013-05-16 10:33:45
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
试试增加酚氯仿抽提次数。每次抽提尽量充分混匀。
赞一下 回复此楼
4楼2013-05-16 12:21:21
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含羞草liu

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-16 12:21:21
试试增加酚氯仿抽提次数。每次抽提尽量充分混匀。

我有增回抽提的次数，但还是会有少许的蛋白污染。
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努力，奋斗，拼搏。。。
5楼2013-05-16 14:04:57
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maxiao1222

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-05-27 10:35:02
对蛋白污染去除贡献最大的是trizol试剂，其次是氯仿，最后是去蛋白液之类的东西，第一步裂解要是没充分的话，后面再怎么小心也是没有用的，先保证充分裂解吧
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好好学习，天天向上
6楼2013-05-27 10:08:02
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maxiao1222

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

劝你还是一次加氯仿就够了，多了对RNA提取影响实在是太大了
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好好学习，天天向上
7楼2013-05-27 10:09:39
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czjlove

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
8楼2013-06-16 03:35:29
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hyphen007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

顶起啊，别给沉了啊，对，楼主问题解决了吧》？咋解决的啊，给分享一下哈，多谢
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10楼2013-07-10 18:30:27
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