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如何去除RNA提取过程中的蛋白质污染
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大家好！我目前正在构建cDNA文库，需要高质量的RNA。提取的材料是杨树叶片，最先我是用Trizol 提取的，提取到的RNA对OD值检测，发现OD260/OD280的范围在1.8~2.0之间，但电泳检测时加样孔总会发亮，也就是会有蛋白质的污染，直接用此法提取的RNA构建文库时总是很不理想。后来，我在takara 购买了RNAiso 试剂配合Fruit-mate试剂进行提取（这两种试剂是针对多糖多酚植物材料的），提取后检测，OD260/OD280的范围在1.8~2.0之间，但电泳时加样孔也会发亮，此法也不能有效的去除蛋白质。之后，我对Trizol提取后的RNA进行LiCL沉淀，配制5M LiCL沉淀液（配制方法为：称取LiCL 42.4g，Tris 0.4846g，EDTA 0.5846g溶于150ml DEPC处理水中，用5N NaOH 高PH 为7.4，之后DEPC处理水定容到200ml，高压灭菌），等量加入提取后的RNA中，-80度静置两小时，拿出后4度，14000rpm离心20min， 弃上清，可看到半透明状的沉淀。用预冷的75%乙醇清洗沉淀一次，7500rpm 离心5min，发现沉淀变成乳白色，加DEPC处理水，发现此沉淀很难溶解（已室温静置约10min，不溶，进行漩涡振荡，也不溶），随后，直接用此未完全溶解的RNA提取样进行检测，发现OD260/OD280大于1.8，有的甚至在2.0以上 ，但制胶电泳检测，加样孔仍会发亮，蛋白质仍旧没有除尽。 对于此文库构建，我已进行半年多，仍旧没有进展，问题总是出现在RNA的提取上。究竟要怎样才能除尽RNA中的蛋白质呢？请高手帮忙，感激不尽！！！ |
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8楼2013-06-16 03:35:29
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cicelyzh
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