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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助 过表达载体一直构建不成功
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xg_sun

铁虫 (初入文坛)

[求助] 求助 过表达载体一直构建不成功

载体是11000左右 目的片段500bp左右 ，载体上用ncol  和 pml双酶切 ，目的片段用ncol同尾酶pcil 和pml双酶切  跑胶纯化回收 连接  摩尔浓度比  载体：目的=1:3  连接16度 过夜 neb公司连接酶 长出白菌落 但是摇菌之后扩增PCR 扩不出目的片段  重复了好几次 都是这情况  求解
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1楼 2013-05-15 17:46:26
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sunnyboylg

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xg_sun: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-05-16 16:18:18
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-16 16:58:07
长出的会不会是假阳性菌，做转化是用空质粒作对照看看；质粒酶切回收测测浓度，可能浓度太低了
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要么读书，要么旅行，身体和灵魂，必须有一个在路上
2楼2013-05-15 22:38:28
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xg_sun: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-05-16 16:18:26
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-16 16:58:15
载体与目的片段大小比较悬殊，试试增加目的片段：载体的比例至1:5-1:10。
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

xg_sun
3楼2013-05-16 07:10:10
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xg_sun

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sunnyboylg at 2013-05-15 22:38:28
长出的会不会是假阳性菌，做转化是用空质粒作对照看看；质粒酶切回收测测浓度，可能浓度太低了

如果有空质粒和 酶切后自己需要的质粒 会不会影响结果 谢谢
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4楼2013-05-16 16:37:09
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xg_sun

铁虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-16 07:10:10
载体与目的片段大小比较悬殊，试试增加目的片段：载体的比例至1:5-1:10。

好的 我试试 谢谢
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5楼2013-05-16 16:37:35
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sunnyboylg

木虫 (正式写手)
你就把空质粒与酶切质粒分开培养，空质粒只是作为对照单独一个平板
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

xg_sun
要么读书，要么旅行，身体和灵魂，必须有一个在路上
6楼2013-05-17 08:58:30
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xg_sun

铁虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by sunnyboylg at 2013-05-17 08:58:30
你就把空质粒与酶切质粒分开培养，空质粒只是作为对照单独一个平板

好的 谢谢
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7楼2013-05-17 09:01:10
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李小冬

金虫 (小有名气)
用的是什么克隆载体呢
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哎呀呀
8楼2013-05-18 09:29:58
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李小冬

金虫 (小有名气)
点错了哈， 请问你用的是什么载体，我正前期准备呢，我计划在引物设计的时候加上酶切位点，然后使用TA克隆完成连接，之后双酶切。如何？
赞一下 回复此楼
哎呀呀
9楼2013-05-18 09:35:26
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xg_sun

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 李小冬 at 2013-05-18 09:35:26
点错了哈， 请问你用的是什么载体，我正前期准备呢，我计划在引物设计的时候加上酶切位点，然后使用TA克隆完成连接，之后双酶切。如何？

可以的
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10楼2013-05-20 12:00:46
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