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憧雪313

银虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白质SDS-PAGE跑的条带很多，但做二维电泳点很少，且纵条纹很多，请教什么原因呢？

提蛋白质，先做个小胶SDS-PAGE，跑出来的条带挺多，也挺清楚的，但是做二维电泳的结果却很不好：点很少，纵条纹很多。用的考马斯亮蓝染色的，操作方法技术都正确，就是找不到原因。求助，求助，求助！！！非常感谢！！！
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1楼 2013-05-14 21:54:00
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
憧雪313(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-15 08:38:51
憧雪313: 金币+1, ★有帮助 2013-05-16 12:02:09
首先，你的上样量够吗？跑一向普通的SDS-PAGE的样品放到二维的2D上的量是不够的，起码需要增加3-5倍。
其次，你说的纵向条纹是什么样的，有图吗？纵向条纹的话，应该是第二向的问题。如果可以排除第二向胶本身的问题的话，有可能是胶条下来变性处理没做好。
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2楼2013-05-15 08:05:39
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DBWJ

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
憧雪313: 金币+1, ★有帮助 2013-05-16 12:00:52
憧雪313: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-05-17 21:59:53
你做的胶条是多少cm的啊？纵条纹是2相的事，最好能传个图，顺便把实验方法附上，这样也好找原因。
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3楼2013-05-15 11:53:56
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憧雪313

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-15 08:05:39
首先，你的上样量够吗？跑一向普通的SDS-PAGE的样品放到二维的2D上的量是不够的，起码需要增加3-5倍。
其次，你说的纵向条纹是什么样的，有图吗？纵向条纹的话，应该是第二向的问题。如果可以排除第二向胶本身的问 ...

我用11cm胶条跑的，上样量300ug，小胶SDS-PAGE上样量是15ug。上样量够的，第二向胶配方应该没什么问题呢，就是在凝胶上放胶条时，加完琼脂糖后胶条与凝胶之间有空隙，不能紧挨着，别的都没什么问题。    呵呵，胶拍照拍的很不好。

小胶SDS-PAGE.jpg



二维胶.jpg
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4楼2013-05-15 14:43:21
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憧雪313

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by DBWJ at 2013-05-15 11:53:56
你做的胶条是多少cm的啊？纵条纹是2相的事，最好能传个图，顺便把实验方法附上，这样也好找原因。

我用酚提取法提取的，材料是水果。
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5楼2013-05-15 14:47:25
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
憧雪313: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-05-16 12:01:43
引用回帖:
4楼: Originally posted by 憧雪313 at 2013-05-15 14:43:21
我用11cm胶条跑的，上样量300ug，小胶SDS-PAGE上样量是15ug。上样量够的，第二向胶配方应该没什么问题呢，就是在凝胶上放胶条时，加完琼脂糖后胶条与凝胶之间有空隙，不能紧挨着，别的都没什么问题。    呵呵，胶拍 ...

胶条与第二向胶面最好不要有空隙，否则会影响蛋白进入第二向胶。你的胶条是否用琼脂糖固定。第二向也最好跑个marker，看是不是胶的问题。从你小SDS胶上看，样品有不少残留在点样孔，是不是你的样品含有较多疏水蛋白，变性比较困难？我的意思说，如果样品变性不容易，可能会影响胶条的in gel变性效果。
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憧雪313
6楼2013-05-15 23:57:29
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憧雪313

银虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-15 23:57:29
胶条与第二向胶面最好不要有空隙，否则会影响蛋白进入第二向胶。你的胶条是否用琼脂糖固定。第二向也最好跑个marker，看是不是胶的问题。从你小SDS胶上看，样品有不少残留在点样孔，是不是你的样品含有较多疏水蛋白 ...

恩恩，谢谢谢谢! 我的胶条用琼脂糖固定，但是我推胶条至第二向胶面时，都不能使胶条紧挨胶面，它们之间总是有空隙，但是没气泡的。 我之前跑的时候加marker的，但是marker总出不完7条带，都是5到6条。配的胶是12%的。  变性比较困难，那怎么解决呢?    还有我跑完二向后把胶条也染色了，发现胶条上还有一些蛋白质没进入二向胶中，这个是不是跟我放胶条也有很大关系啊？ 非常感谢！
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7楼2013-05-16 11:56:36
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
憧雪313: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-05-16 16:32:50
憧雪313: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-05-17 22:00:10
引用回帖:
7楼: Originally posted by 憧雪313 at 2013-05-16 11:56:36
恩恩，谢谢谢谢! 我的胶条用琼脂糖固定，但是我推胶条至第二向胶面时，都不能使胶条紧挨胶面，它们之间总是有空隙，但是没气泡的。 我之前跑的时候加marker的，但是marker总出不完7条带，都是5到6条。配的胶是12%的 ...

胶条中残留少量蛋白也是正常的，不过残留太多就不好了。残留蛋白主要是因为变性不充分，蛋白表面没有充分结合SDS，电荷不够，所以电泳时会跑得非常慢。胶条从第一向下来因为表面有油，油会影响变性时溶液浸入胶条。先用镊子夹住胶条在滤纸上尽量吸去油，然后再进行变性处理。如果变性困难的样品，可以适当延长变性时间，实在不行的话，可以增加变性时的平衡缓冲液中SDS的含量。放胶条也有一定技巧，也很难说清楚。一般是先在第二向胶面上放电泳缓冲液，然后把胶条推到胶面尽量接触，然后再吸去多余的缓冲液，再用琼脂糖固定。
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8楼2013-05-16 12:11:19
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憧雪313

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-16 12:11:19
胶条中残留少量蛋白也是正常的，不过残留太多就不好了。残留蛋白主要是因为变性不充分，蛋白表面没有充分结合SDS，电荷不够，所以电泳时会跑得非常慢。胶条从第一向下来因为表面有油，油会影响变性时溶液浸入胶条。 ...

恩 恩 好的 非常感谢！收获不少。
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9楼2013-05-16 16:32:19
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