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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pcr引物二聚体
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xuqingchun33

银虫 (小有名气)

[求助] pcr引物二聚体

甲基化pcr的目的产物为100bp，但是总有引物二聚体，TM我已经做了梯度了
takala taq酶0.5ul
10xbuffer   2.5ul
dNTP           2ul
水                13ul
模版           5ul
DMSO         1ul
引物各      0.5ul
25ul体系
预变性95度5min
各位高手请问我该怎么办，帮忙给点意见

1.jpg
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在这个纷绕的世俗世界里，能够学会用一颗平常的心去对待周围的一切，也是一种境界。
1楼 2013-05-13 14:49:13
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华农夏田

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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我之前也遇到了类似的问题，师兄说是不可避免的，可以换一下引物或者把引物沸水浴5min,在冰浴1min，试试看吧！希望有所帮助。
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要科研也要生活
2楼2013-05-13 16:51:10
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wangxin320

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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xuqingchun33(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-14 11:02:35
重新设计一下引物吧，设计的时候看看软件上面显示出现dimer的情况，选择没有的就最好了
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3楼2013-05-13 17:52:00
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叶伟伟99

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

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可以换个KOD酶试试，
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4楼2013-05-13 22:01:26
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xy656691

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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引物二聚体是很正常的，如果目的条带能扩出来就好，扩不出来就重新设计引物吧
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5楼2013-05-14 08:54:46
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guojing113

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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xuqingchun33(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-14 11:02:44
把你的引物降低到0.3微升，如果目的序列GC含量没有超过65%的话，把DMSO去掉，DMSO是可以影响扩增效率的，另外如果还是不可以的话，在体系里面加2mM的镁离子，祝好运！
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听雨
6楼2013-05-14 10:25:19
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wspvi

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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降低引物浓度，提高退火温度和hotstart是比较有效的3个措施
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7楼2013-05-14 11:38:50
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mamjun

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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跟2楼有点类似，PCR扩增完，先不电泳，离心管口用封口膜裹严实，沸水煮5min，之后自然冷却至室温，大概要等1h-2h左右，再电泳，以前试过可以让条带变清晰点，但如果还是跟图上这样的话再试试其他办法咯。
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8楼2013-05-14 16:47:26
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q317476148

铁杆木虫 (著名写手)

喵星人

【答案】应助回帖

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你可以把跑胶的时间跑长一点，引物二聚体一般都会比100小点吧。让二聚体和你的带分开一点。
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9楼2013-05-16 12:43:10
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jinrongyu613

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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xuqingchun33: 金币+3, ★★★★★最佳答案 2013-05-16 15:46:18
减少PCR产物中引物二聚体的方法:  
1从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法;
2.可能模板有问题;模板浓度过小，适当加大模板量;  
3.Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度;
4.取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引 物二聚体就会消失的;理由:引物可能会发生发夹结构,自身环化等结构,在100摄氏度下的沸水中煮5分钟可使引物变为单链，以减少二聚体。不过有人认为在 PCR仪上95度变性5min也同样达到目的，而且成功试过通过延长退火时间也可以消除引物二聚体。  
5.所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增强特异性;  
6.PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的 引物合成为二聚体。
7.增加循环数;  
8.降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度(根据扩增片断长度 而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些);  
9.若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在20-25mmol/l没有区别，则考虑 Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不
对。  
10. 以上次的PCR产物作模板二次PCR，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100－1000倍，如果间隔较长可以稀释50－100倍。
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fighting
10楼2013-05-16 14:21:12
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