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xuqingchun33银虫 (小有名气)
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[求助]
pcr引物二聚体
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甲基化pcr的目的产物为100bp，但是总有引物二聚体，TM我已经做了梯度了 takala taq酶0.5ul 10xbuffer 2.5ul dNTP 2ul 水 13ul 模版 5ul DMSO 1ul 引物各 0.5ul 25ul体系 预变性95度5min 各位高手请问我该怎么办，帮忙给点意见  1.jpg |
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jinrongyu613
银虫 (正式写手)
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
xuqingchun33: 金币+3, ★★★★★最佳答案 2013-05-16 15:46:18
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xuqingchun33: 金币+3, ★★★★★最佳答案 2013-05-16 15:46:18
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减少PCR产物中引物二聚体的方法: 1从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法; 2.可能模板有问题;模板浓度过小，适当加大模板量; 3.Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度; 4.取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引 物二聚体就会消失的;理由:引物可能会发生发夹结构,自身环化等结构,在100摄氏度下的沸水中煮5分钟可使引物变为单链，以减少二聚体。不过有人认为在 PCR仪上95度变性5min也同样达到目的，而且成功试过通过延长退火时间也可以消除引物二聚体。 5.所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增强特异性; 6.PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的 引物合成为二聚体。 7.增加循环数; 8.降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度(根据扩增片断长度 而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些); 9.若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在20-25mmol/l没有区别，则考虑 Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不 对。 10. 以上次的PCR产物作模板二次PCR，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100－1000倍，如果间隔较长可以稀释50－100倍。 |
10楼2013-05-16 14:21:12
2楼2013-05-13 16:51:10
wangxin320
银虫 (小有名气)
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3楼2013-05-13 17:52:00
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