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xuqingchun33

银虫 (小有名气)

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[求助] pcr引物二聚体

甲基化pcr的目的产物为100bp，但是总有引物二聚体，TM我已经做了梯度了
takala taq酶0.5ul
10xbuffer 2.5ul
dNTP          2ul
水             13ul
模版          5ul
DMSO       1ul
引物各    0.5ul
25ul体系
预变性95度5min
各位高手请问我该怎么办，帮忙给点意见

1.jpg

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在这个纷绕的世俗世界里，能够学会用一颗平常的心去对待周围的一切，也是一种境界。

1楼 2013-05-13 14:49:13

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jinrongyu613

银虫 (正式写手)

应助: 1 (幼儿园)
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【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xuqingchun33: 金币+3, ★★★★★最佳答案 2013-05-16 15:46:18

减少PCR产物中引物二聚体的方法:
1从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法;
2.可能模板有问题;模板浓度过小，适当加大模板量;
3.Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度;
4.取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的;理由:引物可能会发生发夹结构,自身环化等结构,在100摄氏度下的沸水中煮5分钟可使引物变为单链，以减少二聚体。不过有人认为在 PCR仪上95度变性5min也同样达到目的，而且成功试过通过延长退火时间也可以消除引物二聚体。
5.所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增强特异性;
6.PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体。
7.增加循环数;
8.降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度(根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些);
9.若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在20-25mmol/l没有区别，则考虑 Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不
对。
10. 以上次的PCR产物作模板二次PCR，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100－1000倍，如果间隔较长可以稀释50－100倍。