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dafeizizhu

铜虫 (小有名气)


[交流] 质粒提取后dot blot技术相关问题

最近,在分子生物里给别人解释PCR,电泳,酶切酶连等问题,到现在,我自己的问题还要提交到这里请求大神们指导:我所做的实验是抑制性消减杂交文库的初步筛选,使用的技术是clontech公司PCR-select differential screening kit(637403)中思路。起初是按照本实验指导方法制样,杂交;显色是用DIG探针结合DAB来进行的,因为clontech公司的试剂盒是放射性32-p显色,就没有采用。经过长时间的摸索,发现按照clontech公司试剂盒的方法制样点膜,膜上的样品非常的少,由于DIG探针的灵敏度不如放射性32-p,导致实验没有结果。研究了clontech试剂盒的过程,发现,它提供的方法中,将克隆印在尼龙膜上,尼龙膜过夜在LB培养基上培养,然后在碱液中裂解,在中和液里中和,尼龙膜上结合的裂解物是非常复杂的混合物。我就想,通过一定的方法,提高印在尼龙膜上的样品量,以便利于膜杂交实验(dot blot)。于是就采用了在96孔板里提取质粒的方法,将菌液裂解中和后,就直接点到尼龙膜上,然后杂交。我认为这样处理是合理的,因为点的样同样是混合物,并且提取质粒过程中,有一步骤是离心的,将大部分的基因组核酸和蛋白质沉淀了,而质粒留在上清液中,样品浓度增加了。起初,用此方法,得到了一个很好的结果,非常漂亮。而后我将质粒提取后点膜的方法应用于大批量实验中,怎么也杂交不出来结果。认为探针质量不行,检验之后发现没有问题,认为质粒提取手法不同,经过验证,不是问题,杂交条件使用的是出来结果的那次条件,一直未变。探针浓度一直维持在500-1000ng/ul左右,并且发现探针浓度偏低反而结果更好。我就不明白了,是什么原因导致这样的结果,同样的方法,不同的操作批次,就是得不到可重复的结果。还请求大神们给个指导!难道真的是质粒提取有问题?还是杂交过程中有问题?在每次试验,我都拿出来结果的那个样品做阳性对照,屡试不爽,而新制样品就是没有结果。有图上传,我就是想在新制的样品中能达到下面两张膜的结果就行。

上面两张尼龙膜是clontech试剂盒的方法制样并杂交结果,下面两张尼龙膜是我自己提取质粒后点膜杂交结果。探针DIG,NBT/BCIP显色
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wsglpglp

铜虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
试剂盒有时可能就是不如传统的抽提方法,那就不用试剂盒了吧

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
2楼2013-05-07 19:34:16
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dafeizizhu

铜虫 (小有名气)


引用回帖:
2楼: Originally posted by wsglpglp at 2013-05-07 19:34:16
试剂盒有时可能就是不如传统的抽提方法,那就不用试剂盒了吧

可是我现在也重复不了自己所使用的传统方法。我真心求助于大神,能否帮我解决问题。
3楼2013-05-07 20:32:42
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