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质粒提取后dot blot技术相关问题
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最近，在分子生物里给别人解释PCR，电泳，酶切酶连等问题，到现在，我自己的问题还要提交到这里请求大神们指导：我所做的实验是抑制性消减杂交文库的初步筛选，使用的技术是clontech公司PCR-select differential screening kit（637403）中思路。起初是按照本实验指导方法制样，杂交；显色是用DIG探针结合DAB来进行的，因为clontech公司的试剂盒是放射性32-p显色，就没有采用。经过长时间的摸索，发现按照clontech公司试剂盒的方法制样点膜，膜上的样品非常的少，由于DIG探针的灵敏度不如放射性32-p，导致实验没有结果。研究了clontech试剂盒的过程，发现，它提供的方法中，将克隆印在尼龙膜上，尼龙膜过夜在LB培养基上培养，然后在碱液中裂解，在中和液里中和，尼龙膜上结合的裂解物是非常复杂的混合物。我就想，通过一定的方法，提高印在尼龙膜上的样品量，以便利于膜杂交实验（dot blot）。于是就采用了在96孔板里提取质粒的方法，将菌液裂解中和后，就直接点到尼龙膜上，然后杂交。我认为这样处理是合理的，因为点的样同样是混合物，并且提取质粒过程中，有一步骤是离心的，将大部分的基因组核酸和蛋白质沉淀了，而质粒留在上清液中，样品浓度增加了。起初，用此方法，得到了一个很好的结果，非常漂亮。而后我将质粒提取后点膜的方法应用于大批量实验中，怎么也杂交不出来结果。认为探针质量不行，检验之后发现没有问题，认为质粒提取手法不同，经过验证，不是问题，杂交条件使用的是出来结果的那次条件，一直未变。探针浓度一直维持在500-1000ng/ul左右，并且发现探针浓度偏低反而结果更好。我就不明白了，是什么原因导致这样的结果，同样的方法，不同的操作批次，就是得不到可重复的结果。还请求大神们给个指导！难道真的是质粒提取有问题？还是杂交过程中有问题？在每次试验，我都拿出来结果的那个样品做阳性对照，屡试不爽，而新制样品就是没有结果。有图上传，我就是想在新制的样品中能达到下面两张膜的结果就行。 上面两张尼龙膜是clontech试剂盒的方法制样并杂交结果，下面两张尼龙膜是我自己提取质粒后点膜杂交结果。探针DIG，NBT/BCIP显色 |
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