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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助双酶切切不开
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囧囧俏

铁虫 (小有名气)

[求助] 求助双酶切切不开

将一个500bp的基因连到载体PET26b上，pcr结果阳性，酶切切不开，挑了好几个样都是如此，送去测序后证明基因在载体上
现在要将一个500的基因连在已有500片段的PET26上，又是切不开？
求解决方案！！谢谢各位
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1楼 2013-05-04 19:11:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
说说你具体的酶切过程，用的是哪两个酶？
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-05-04 19:14:13
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senix

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 回帖置顶 2013-05-04 19:52:59
囧囧俏(amisking代发): 金币+1, 鼓励发帖交流！ 2013-05-04 19:53:07
测序结果有没有看那两个酶切位点序列是否正确？
或者，酶失活了，换新酶！
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做实验就是和上帝玩游戏！
3楼2013-05-04 19:46:06
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意孤城_

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
有些酶切位点容易甲基化就会导致你说的这种情况，但是还是要看你的到底怎么回事，没说清楚
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4楼2013-05-04 20:36:44
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囧囧俏

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by senix at 2013-05-04 19:46:06
测序结果有没有看那两个酶切位点序列是否正确？
或者，酶失活了，换新酶！

酶切位点正确 两个酶没有问题
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5楼2013-05-05 15:06:57
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囧囧俏

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-05-04 19:14:13
说说你具体的酶切过程，用的是哪两个酶？

BamhI XholI Kbuffer
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6楼2013-05-05 15:07:34
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囧囧俏

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 意孤城_ at 2013-05-04 20:36:44
有些酶切位点容易甲基化就会导致你说的这种情况，但是还是要看你的到底怎么回事，没说清楚

测序后酶切位点没有突变
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7楼2013-05-05 15:08:01
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囧囧俏

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by senix at 2013-05-04 19:46:06
测序结果有没有看那两个酶切位点序列是否正确？
或者，酶失活了，换新酶！

两个位点正确 酶是新的没问题
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8楼2013-05-05 15:08:46
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dafeizizhu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-05-07 08:35:53
内切酶一般情况下对样品中离子，蛋白，糖类等物质比较敏感，要完成好的酶切效果，干净的样品是必须的。在你整个实验中，没有发现你对样品的任何处理，是不是直接拿质粒酶切？我建议将提取好的质粒使用酚氯仿法抽提去除离子和蛋白等杂质。然后再酶切。
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9楼2013-05-06 08:17:10
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囧囧俏

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by dafeizizhu at 2013-05-06 08:17:10
内切酶一般情况下对样品中离子，蛋白，糖类等物质比较敏感，要完成好的酶切效果，干净的样品是必须的。在你整个实验中，没有发现你对样品的任何处理，是不是直接拿质粒酶切？我建议将提取好的质粒使用酚氯仿法抽提去 ...

质粒是用上海生工的试剂盒提取的，以前也是用这个提取后直接酶切没有任何问题
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10楼2013-05-06 09:59:26
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