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囧囧俏

铁虫 (小有名气)

[求助] 求助双酶切切不开

将一个500bp的基因连到载体PET26b上,pcr结果阳性,酶切切不开,挑了好几个样都是如此,送去测序后证明基因在载体上
现在要将一个500的基因连在已有500片段的PET26上,又是切不开?
求解决方案!!谢谢各位
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
说说你具体的酶切过程,用的是哪两个酶?
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-05-04 19:14:13
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senix

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
amisking: 回帖置顶 2013-05-04 19:52:59
囧囧俏(amisking代发): 金币+1, 鼓励发帖交流! 2013-05-04 19:53:07
测序结果有没有看那两个酶切位点序列是否正确?
或者,酶失活了,换新酶!
做实验就是和上帝玩游戏!
3楼2013-05-04 19:46:06
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意孤城_

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
有些酶切位点容易甲基化就会导致你说的这种情况,但是还是要看你的到底怎么回事,没说清楚
4楼2013-05-04 20:36:44
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囧囧俏

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by senix at 2013-05-04 19:46:06
测序结果有没有看那两个酶切位点序列是否正确?
或者,酶失活了,换新酶!

酶切位点正确 两个酶没有问题
5楼2013-05-05 15:06:57
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囧囧俏

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-05-04 19:14:13
说说你具体的酶切过程,用的是哪两个酶?

BamhI XholI Kbuffer
6楼2013-05-05 15:07:34
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囧囧俏

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 意孤城_ at 2013-05-04 20:36:44
有些酶切位点容易甲基化就会导致你说的这种情况,但是还是要看你的到底怎么回事,没说清楚

测序后酶切位点没有突变
7楼2013-05-05 15:08:01
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囧囧俏

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by senix at 2013-05-04 19:46:06
测序结果有没有看那两个酶切位点序列是否正确?
或者,酶失活了,换新酶!

两个位点正确 酶是新的没问题
8楼2013-05-05 15:08:46
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dafeizizhu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-05-07 08:35:53
内切酶一般情况下对样品中离子,蛋白,糖类等物质比较敏感,要完成好的酶切效果,干净的样品是必须的。在你整个实验中,没有发现你对样品的任何处理,是不是直接拿质粒酶切?我建议将提取好的质粒使用酚氯仿法抽提去除离子和蛋白等杂质。然后再酶切。
9楼2013-05-06 08:17:10
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囧囧俏

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by dafeizizhu at 2013-05-06 08:17:10
内切酶一般情况下对样品中离子,蛋白,糖类等物质比较敏感,要完成好的酶切效果,干净的样品是必须的。在你整个实验中,没有发现你对样品的任何处理,是不是直接拿质粒酶切?我建议将提取好的质粒使用酚氯仿法抽提去 ...

质粒是用上海生工的试剂盒提取的,以前也是用这个提取后直接酶切没有任何问题
10楼2013-05-06 09:59:26
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