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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 片段连接失败
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梦锁深秋2005

银虫 (小有名气)

[交流] 片段连接失败

我是556bp的片段，连接在PUC19的质粒上，用的KpnⅠ和BamHⅠ双酶切，转化涂板后质粒粗提精提均比原始质粒高一点，但PCR验证、酶切验证均没有条带，只有一些二聚体，求解释！
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1楼 2013-05-03 14:00:33
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意孤城_

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
梦锁深秋2005(gyesang代发): 金币+2, good, 同时需要减少酶切模板的量，保证载体双酶切干净哦！ 2013-05-03 18:06:33
gyesang: 回帖置顶 2013-05-03 18:06:38
转化涂板后质粒粗提精提均比原始质粒高一点  什么意思？没切出来就说明片段没有连接进去，能提出来是载体自连的原因，建议酶切载体的时候加大酶切时间，保证切干净，同时做个阴性对照，不加片段，让载体自连看看和实验组的差距，如果长得一样多，那就不能用
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3楼2013-05-03 16:41:35
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gzl9901

铁杆木虫 (文坛精英)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
祝福，，祝福祝福，，努力，再努力！再创佳绩！
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2楼2013-05-03 14:48:10
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20083630zhan

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
梦锁深秋2005(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-03 18:06:47
我觉得你应该在酶切回收之后先跑一个电泳看看，你到底是否会受到目的片段，然后再连接，因为有的是后你回收的产物太少，或者是根本没有会受到，
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4楼2013-05-03 16:49:41
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wangqi1107

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
图片发过来看看，高一点事什么意思？
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5楼2013-05-03 16:57:55
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梦锁深秋2005

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 意孤城_ at 2013-05-03 16:41:35
转化涂板后质粒粗提精提均比原始质粒高一点  什么意思？没切出来就说明片段没有连接进去，能提出来是载体自连的原因，建议酶切载体的时候加大酶切时间，保证切干净，同时做个阴性对照，不加片段，让载体自连看看和实 ...

这是质粒精提的电泳图，第二个和最后一个是原始质粒。酶切时间用了4个小时呢

2013-04-26（2） - 副本 (2).jpg

[ Last edited by 梦锁深秋2005 on 2013-5-6 at 09:43 ]
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7楼2013-05-06 09:41:21
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梦锁深秋2005

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by wangqi1107 at 2013-05-03 16:57:55
图片发过来看看，高一点事什么意思？

这是精提的电泳图，maker是5000的，第二个和最后一个是原始质粒

2013-04-26（2） - 副本 (2).jpg
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8楼2013-05-06 09:42:44
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意孤城_

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
梦锁深秋2005(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-06 12:30:52
有可能是杂菌污染，我之前也出现过这种情况，PCR能P出来，在抗性培养基也能长起来，酶切大小也对着，结果测序不对，是被一种杂菌污染了
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9楼2013-05-06 11:28:41
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梦锁深秋2005

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 意孤城_ at 2013-05-06 11:28:41
有可能是杂菌污染，我之前也出现过这种情况，PCR能P出来，在抗性培养基也能长起来，酶切大小也对着，结果测序不对，是被一种杂菌污染了

你的意思是感受态里有杂菌，还是在做转化涂板的过程中污染了？
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10楼2013-05-06 13:05:50
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意孤城_

金虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 梦锁深秋2005 at 2013-05-06 13:05:50
你的意思是感受态里有杂菌，还是在做转化涂板的过程中污染了？...

摇菌的过程中
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11楼2013-05-07 22:00:03
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梦锁深秋2005

银虫 (小有名气)
我换了一批感受态，效果挺好，酶切验证时间换用了两个小时。可能是感受态的问题吧！
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12楼2013-05-14 09:49:20
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yingying15886楼
2013-05-03 21:13   回复  
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