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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白纯化疑问
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aoda123

木虫 (正式写手)

[求助] 蛋白纯化疑问

我诱导表达的蛋白跑胶后，上清中较多，但在过柱子后，搜集的洗液中没有蛋白（组氨酸标签）。
是不是蛋白没有挂上柱子呢？怎么验证呢？
洗脱液的pH要跟蛋白的等电点一致吗？
请大家赐教
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身体健康，工作顺利
1楼 2013-04-21 10:50:24
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
aoda123(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天 2013-04-21 18:33:34
aoda123: 金币+3, ★有帮助 2013-04-21 21:38:59
如果你收集了穿流组分，跑胶检查一下就可以得知目标蛋白是否挂上柱。你过的是什么柱？洗脱液的pH应该避免蛋白的等电点，否则蛋白容易发生沉淀。
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2楼2013-04-21 11:39:07
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suwc2013

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+5, 鼓励新虫子来到生物版块交流，期待你的精彩 2013-04-21 18:33:57
aoda123: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-04-21 21:39:57
洗脱时，有可能一部分跑到流穿里了，也可能你的蛋白降解，洗脱的ph应该偏离蛋白的等电点。
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。。。。。。。。
3楼2013-04-21 14:32:15
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panyuzhu

禁虫 (小有名气)
★
myprayer: 金币+1, 鼓励新虫子来到生物版块交流，期待你的精彩 2013-04-21 18:34:19
本帖内容被屏蔽
4楼2013-04-21 17:20:11
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aoda123

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by panyuzhu at 2013-04-21 11:20:11
pet系列的表达载体吧，感觉组氨酸标签很难挂柱，基本都给流川了。
换个方法吧
疏水
离子交换

我做的蛋白有很强的疏水性，预测达到74%，所以在蛋白前面加了疏水性蛋白序列。这会不会对His标签有影响？
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身体健康，工作顺利
5楼2013-04-21 21:34:38
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aoda123

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-21 05:39:07
如果你收集了穿流组分，跑胶检查一下就可以得知目标蛋白是否挂上柱。你过的是什么柱？洗脱液的pH应该避免蛋白的等电点，否则蛋白容易发生沉淀。

我用的是Ni 柱。收集的串流组分跑胶后基本看不见蛋白。但是在超声之后离心的上清中跑胶能见到很多目的蛋白。再有pH要偏离多少合适呢？
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身体健康，工作顺利
6楼2013-04-21 21:38:33
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aoda123

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by suwc2013 at 2013-04-21 08:32:15
洗脱时，有可能一部分跑到流穿里了，也可能你的蛋白降解，洗脱的ph应该偏离蛋白的等电点。

pH要偏离多少合适呢？
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身体健康，工作顺利
7楼2013-04-21 21:39:31
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
6楼: Originally posted by aoda123 at 2013-04-21 21:38:33
我用的是Ni 柱。收集的串流组分跑胶后基本看不见蛋白。但是在超声之后离心的上清中跑胶能见到很多目的蛋白。再有pH要偏离多少合适呢？...

如果是这样，可能是蛋白没有洗脱下来，你用的洗脱液咪唑浓度多少，洗了几个柱身体积？pH一般能偏离2就行了。此外，一般的亲和柱溶液里都含有一定的NaCl，可以减少蛋白沉淀。
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8楼2013-04-22 00:56:57
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aoda123

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-21 18:56:57
如果是这样，可能是蛋白没有洗脱下来，你用的洗脱液咪唑浓度多少，洗了几个柱身体积？pH一般能偏离2就行了。此外，一般的亲和柱溶液里都含有一定的NaCl，可以减少蛋白沉淀。...

我们实验室用的咪唑浓度500mM，最后洗脱十次，每次1毫升
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身体健康，工作顺利
9楼2013-04-22 09:20:33
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
9楼: Originally posted by aoda123 at 2013-04-22 09:20:33
我们实验室用的咪唑浓度500mM，最后洗脱十次，每次1毫升...

咪唑的浓度应该是没问题的。你的镍柱的体积是多少？一般洗脱体积要根据柱体积算，4-5个体积应该可以完全洗脱下来。
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10楼2013-04-22 23:55:50
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