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孔家姗妮

新虫 (小有名气)

[求助] 测序总是失败，什么原因

最近拿到了一种新病毒的序列，PCR扩增出全长，大小对得上，但做完克隆测序后拿到的序列总是比目的序列大70-90bp，不是目的序列，是叶绿体或是其他，但是PCR扩增是并未见到比其大70-90bp的条带，什么原因，急求解，我该怎么改进，万分感谢
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1楼 2013-04-05 21:09:04
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可乐汀

捐助贵宾 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-04-07 17:26:41
你拿到的样品是直接测序的还是你自己处理过之后再测序的？如果是自己处理过的，再斟酌一下实验过程，包括引物等，看得到的到底是否是目的序列。
你PCR扩增出的条带是跑胶分析的全长吗？MARKER用的是2000bp的还是多少？70-90的差别在条带上能明显看出吗？
如果测序出的是单一条带但是非目的条带，猜测还是样品处理的问题。
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2楼2013-04-05 21:13:45
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孔家姗妮

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 可乐汀 at 2013-04-05 21:13:45
你拿到的样品是直接测序的还是你自己处理过之后再测序的？如果是自己处理过的，再斟酌一下实验过程，包括引物等，看得到的到底是否是目的序列。
你PCR扩增出的条带是跑胶分析的全长吗？MARKER用的是2000bp的还是多 ...

样品是自己处理之后，也就是做完克隆菌液PCR鉴定条带大小对，再送去测序的
是分析的全长，本身全长就不到500bp，是用的2000的marker,但同时也用100 plus ladder了，大小都对得上，跑琼脂糖凝胶也跑PAGE胶了，还是对得上大小，70到90的差别在PAGE胶上是明显看到的
拿菌液测序测出来比目的条带大，拿PCR产物测序显示信号弱，但PCR产物当时跑胶是非常亮且单一的

哎，真不知该怎么办了，重复了好几次了额，求大神帮帮忙，你说的那几点我都改进过了
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3楼2013-04-06 15:58:22
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可乐汀

捐助贵宾 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 孔家姗妮 at 2013-04-06 15:58:22
样品是自己处理之后，也就是做完克隆菌液PCR鉴定条带大小对，再送去测序的
是分析的全长，本身全长就不到500bp，是用的2000的marker,但同时也用100 plus ladder了，大小都对得上，跑琼脂糖凝胶也跑PAGE胶了，还是 ...

。。。那不清楚了。。
没帮上忙。。不过预祝实验早日成功~O(∩_∩)O~
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4楼2013-04-07 00:00:06
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孔家姗妮

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 可乐汀 at 2013-04-07 00:00:06
。。。那不清楚了。。
没帮上忙。。不过预祝实验早日成功~O(∩_∩)O~...

呵呵，谢谢了
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5楼2013-04-07 09:51:37
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study韩

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-04-07 17:26:55
第一种可能,样品其实并不纯（依你描述来看，可能性较小）！第二中可能，引物设计出了问题，因为克隆出来的不是目的片段。我觉得还是重新设计一下引物，尽量避开目的片段与叶绿体上的同源区域，使引物有较高的特异性！
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6楼2013-04-07 10:25:44
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