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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » T-A克隆一直做不出来
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犁头狗

新虫 (初入文坛)

[求助] T-A克隆一直做不出来

片段345bp，用Taq酶扩增纯化后测得浓度为49.3ng/ul，用Takara pmd 19-T simple vector试剂盒连接，严格按照说明书操作，感受态细胞为DH5a，蓝白斑筛选结果 阴性对照没有菌落，阳性对照均为白色菌落，但是实验平板上却全是蓝色菌落，重复三次结果都一样，不知道原因在哪啊？
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1楼 2013-03-17 22:37:27
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

j2

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用的什么酶扩增的？高保增需要加A的

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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修炼ｉｎｇ，当虫仙……
4楼2013-03-18 09:02:48
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robustli

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-06-01 11:08:11
你可以随便扩增一条不相关的片度，试试看能不能插进去，如果能，就针对目的基因设计一条引物。
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immunologyparasite
5楼2013-03-18 10:08:41
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skywards

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-06-01 11:08:22
可以随机挑取几个蓝色菌落用PCR鉴定一下，因为插入片度大小因素也会导致克隆成功但呈现的是蓝色菌落的。
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6楼2013-03-18 12:17:34
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Renavatio

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
4楼: Originally posted by j2 at 2013-03-18 09:02:48
用的什么酶扩增的？高保增需要加A的

我也觉得，得看是什么酶，我做的时候，回收之后都不测浓度，直接连接，而且还是室温连两三个小时之后就转化，效果也还是可以的
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Undefined！
7楼2013-03-18 15:43:24
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虫子火箭兵

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
载体的问题么？试试其他的对照  或者加点A试试
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8楼2013-03-18 22:41:49
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南海所老龚

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励应助！ 2013-03-19 18:40:37
做不出来原因很多，得一个个对照排除。我前段时间也是一直做不出来，琢磨了好久，后来发现是氨苄的问题。
我认为你可以从以下几个方面来分析：
1）PCR产物（楼上也指出是不是酶的问题，或者扩增其他片段做克隆，看有无类似的结果）
2）连接载体
3）感受态（我们课题组发现有些公司的感受态分批次，有时候整一批感受态都不好用，你可以换其他公司产品试试）
4）如果在操作上没问题，也就是说你以前用同样的操作做出来克隆的话，那就重点考虑以上3点。个人意见，仅供参考，祝顺利！
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TheBestandMostBeautifulThingsintheWorldCan'tBeSeenorTouched,TheyMustBeFeltwithHeart.
9楼2013-03-19 08:41:45
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犁头狗

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by j2 at 2013-03-18 09:02:48
用的什么酶扩增的？高保增需要加A的

天跟的taq酶扩增的，会加A的啊
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10楼2013-03-19 15:53:18
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tuodecai

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励应助！ 2013-03-21 11:09:57
没得说，这肯定是Rp问题！  嘿嘿     按理来说，300多bp的片段不管连啥T载体   应该会长一满板的菌才对啊。难道你就长几个了，而且全是蓝的。不太可能吧？  其实几百bp的片段连T载体的话，就算不蓝白斑筛选的话，至少你10个克隆至少也有7-8个阳性克隆了。我连T载体的曾经连过10kb的，宝生物的18.19T连个5-6kb是没问题的  而且也不用过夜16度1-2小时就够了  像你这么长的  室温5分钟就够了。我看你应该是个新手吧？不管你浓度多大，连接比例多少，只要是你的片段带A，载体1u,片段4u，solutionI 5u.再转化没问题，保你长出来的挑都挑不完。至少80%是阳性克隆了。
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13楼2013-03-20 14:16:48
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tuodecai

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
12楼: Originally posted by 犁头狗 at 2013-03-19 15:56:54
我用的是天跟的Mix，里面已经包括ATCG了，难道要额外添加一些A吗？...

用的mix  肯定不用再加dntp了
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14楼2013-03-20 14:18:40
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20083630zhan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你测浓度的时候260/280的比值是多少，有可能是你回收的DNA不是很纯，里面带有乙醇。再者就是你片段与载体的连接比例的问题。
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18楼2013-05-30 13:46:11
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tuodecai

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by zfj20110603 at 2013-05-30 13:26:02
10kb连T载体，你是怎么连的呀？是PCR扩增10KB吗？用什么酶扩增的呀？...

其实像这种T载体（质粒载体）一般插入个10kb，基本上已经是极限了，再大也就一稳定了。我的10kb片段是PCR扩增的，扩这么长的片段的酶可多了，基本上每个公司都有的。不过得看保真性，若是不看保真性，就看扩增长度的话，有的长片段酶都可以扩40多kb了。
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19楼2013-05-31 23:53:59
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wjzpwyz

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

连接时间不要过夜，按照按照说明书上的时间连，如果T载体质量不好，过夜往往会把t载体变成平末端这样就都自连了
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20楼2013-06-02 19:40:15
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莓林塔

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

纠结了我一个多月的TA克隆问题，事实上是我们的感受态只能转进去质粒，重组的载体就转不进去！！很奇怪，但这就是事实，换个商品化的感受态试试吧！反正各种可能都有的，你阳性对照分别做control insert和质粒的，同时试试！！
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21楼2013-06-02 22:16:26
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窝窝头

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

换平板，换载体再试。
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23楼2013-06-03 16:48:12
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南海所老龚

新虫 (正式写手)
引用回帖:
22楼: Originally posted by 冰风颤木 at 2013-06-03 13:39:01
楼主你怎么发现是氨苄的问题啊？求解...

这就需要时间和耐心，一一排除了。
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24楼2013-06-04 08:54:18
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王者归来001

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

得看酶是不是高保真的，高保真的酶PCR反应后3·没有A尾，就连接不上。需要加尾反应
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坚持不懈,终会成功!
25楼2013-06-04 23:11:24
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ivyvampire

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

天啊，TA克隆是最好做的，一般一做，挑四个，至少3个都是阳性那种。我直接做载体连接，基本都是一次性就成功了。周期三四天吧，总结了一下，水酶神马的，最好都是自己用，不要和人混用，哪里出问题了都不知道！
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27楼2013-07-30 11:06:38
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ivyvampire

新虫 (正式写手)

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引用回帖:
21楼: Originally posted by 莓林塔 at 2013-06-02 22:16:26
纠结了我一个多月的TA克隆问题，事实上是我们的感受态只能转进去质粒，重组的载体就转不进去！！很奇怪，但这就是事实，换个商品化的感受态试试吧！反正各种可能都有的，你阳性对照分别做control insert和质粒的，同 ...

事实上，是连接效率不够，我买的感受态转质粒那是满板，转连接产物只长一个，幸好是阳性，但是我换了一个连接酶，同样条件就长了十多个
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28楼2013-07-30 11:09:09
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liyu0355

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-03-18 18:04:11
实验平板上却全是蓝色菌落,说明片段没连上.

Vector DNA和Insert DNA的摩尔比一般为：1：2～10。

你连接时间是多久呢??

我们实验室通常连接过夜呢.
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2楼2013-03-17 22:59:20
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犁头狗

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by liyu0355 at 2013-03-17 22:59:20
实验平板上却全是蓝色菌落,说明片段没连上.

Vector DNA和Insert DNA的摩尔比一般为：1：2～10。

你连接时间是多久呢??

我们实验室通常连接过夜呢.

我也是连接过夜的
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3楼2013-03-17 23:07:57
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