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犁头狗

新虫 (初入文坛)

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[求助] T-A克隆一直做不出来

片段345bp，用Taq酶扩增纯化后测得浓度为49.3ng/ul，用Takara pmd 19-T simple vector试剂盒连接，严格按照说明书操作，感受态细胞为DH5a，蓝白斑筛选结果阴性对照没有菌落，阳性对照均为白色菌落，但是实验平板上却全是蓝色菌落，重复三次结果都一样，不知道原因在哪啊？

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1楼 2013-03-17 22:37:27

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tuodecai

铁杆木虫 (著名写手)

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【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励应助！ 2013-03-21 11:09:57

没得说，这肯定是Rp问题！嘿嘿按理来说，300多bp的片段不管连啥T载体应该会长一满板的菌才对啊。难道你就长几个了，而且全是蓝的。不太可能吧？其实几百bp的片段连T载体的话，就算不蓝白斑筛选的话，至少你10个克隆至少也有7-8个阳性克隆了。我连T载体的曾经连过10kb的，宝生物的18.19T连个5-6kb是没问题的而且也不用过夜16度1-2小时就够了像你这么长的室温5分钟就够了。我看你应该是个新手吧？不管你浓度多大，连接比例多少，只要是你的片段带A，载体1u,片段4u，solutionI 5u.再转化没问题，保你长出来的挑都挑不完。至少80%是阳性克隆了。