24小时热门版块排行榜    

查看: 3497  |  回复: 28

犁头狗

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 南海所老龚 at 2013-03-19 08:41:45
做不出来原因很多,得一个个对照排除。我前段时间也是一直做不出来,琢磨了好久,后来发现是氨苄的问题。
我认为你可以从以下几个方面来分析:
1)PCR产物(楼上也指出是不是酶的问题,或者扩增其他片段做克隆,看 ...

谢谢!
11楼2013-03-19 15:54:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

犁头狗

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 虫子火箭兵 at 2013-03-18 22:41:49
载体的问题么?试试其他的对照  或者加点A试试

我用的是天跟的Mix,里面已经包括ATCG了,难道要额外添加一些A吗?
12楼2013-03-19 15:56:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tuodecai

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励应助! 2013-03-21 11:09:57
没得说,这肯定是Rp问题!  嘿嘿     按理来说,300多bp的片段不管连啥T载体   应该会长一满板的菌才对啊。难道你就长几个了,而且全是蓝的。不太可能吧?  其实几百bp的片段连T载体的话,就算不蓝白斑筛选的话,至少你10个克隆至少也有7-8个阳性克隆了。我连T载体的曾经连过10kb的,宝生物的18.19T连个5-6kb是没问题的  而且也不用过夜16度1-2小时就够了  像你这么长的  室温5分钟就够了。我看你应该是个新手吧?不管你浓度多大,连接比例多少,只要是你的片段带A,载体1u,片段4u,solutionI 5u.再转化没问题,保你长出来的挑都挑不完。至少80%是阳性克隆了。
13楼2013-03-20 14:16:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tuodecai

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
12楼: Originally posted by 犁头狗 at 2013-03-19 15:56:54
我用的是天跟的Mix,里面已经包括ATCG了,难道要额外添加一些A吗?...

用的mix  肯定不用再加dntp了
14楼2013-03-20 14:18:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zr281069

银虫 (小有名气)

我也做了同样的实验  也出现连不上去的结果
人物
15楼2013-03-20 20:58:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

莓林塔

木虫 (小有名气)

同命相连的人我TA克隆已经做了至少20天了,今早又浪费了12个板子。。。我所有的东西都换过了还是不行。。。。就说出鬼了!!
16楼2013-05-19 13:21:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zfj20110603

金虫 (小有名气)

引用回帖:
13楼: Originally posted by tuodecai at 2013-03-20 14:16:48
没得说,这肯定是Rp问题!  嘿嘿     按理来说,300多bp的片段不管连啥T载体   应该会长一满板的菌才对啊。难道你就长几个了,而且全是蓝的。不太可能吧?  其实几百bp的片段连T载体的话,就算不蓝白斑筛选的话,至 ...

10kb连T载体,你是怎么连的呀?是PCR扩增10KB吗?用什么酶扩增的呀?
17楼2013-05-30 13:26:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

20083630zhan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你测浓度的时候260/280的比值是多少,有可能是你回收的DNA不是很纯,里面带有乙醇。再者就是你片段与载体的连接比例的问题。
18楼2013-05-30 13:46:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tuodecai

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
17楼: Originally posted by zfj20110603 at 2013-05-30 13:26:02
10kb连T载体,你是怎么连的呀?是PCR扩增10KB吗?用什么酶扩增的呀?...

其实像这种T载体(质粒载体)一般插入个10kb,基本上已经是极限了,再大也就一稳定了。我的10kb片段是PCR扩增的,扩这么长的片段的酶可多了,基本上每个公司都有的。不过得看保真性,若是不看保真性,就看扩增长度的话,有的长片段酶都可以扩40多kb了。
19楼2013-05-31 23:53:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wjzpwyz

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

连接时间不要过夜,按照按照说明书上的时间连,如果T载体质量不好,过夜往往会把t载体变成平末端这样就都自连了
20楼2013-06-02 19:40:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 犁头狗 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考博] 售SCI一区文章,我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 Ocx3OKOzGU4q 2026-08-03 8/400 2026-08-04 13:15 by jzdxtiUmJ6PL
[公派出国] 售SCI一区T0P文章,我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 Ocx3OKOzGU4q 2026-08-03 8/400 2026-08-04 13:15 by jzdxtiUmJ6PL
[教师之家] 售SCI一区文章,我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +5 jRl3mE6ddZGq 2026-08-03 11/550 2026-08-04 12:58 by jzdxtiUmJ6PL
[基金申请] 娱乐 +4 Tide man 2026-08-03 4/200 2026-08-04 11:51 by wgch518
[基金申请] 纯娱乐,不喜欢勿喷 +5 Tide man 2026-08-04 8/400 2026-08-04 11:43 by everxc
[考研] 售SCI-T0P文章,我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 Ocx3OKOzGU4q 2026-08-03 6/300 2026-08-04 11:34 by MWRYsWbJw4DE
[基金申请] 面上提前没消息,有中的吗 +14 archvillain 2026-08-02 17/850 2026-08-04 09:46 by archvillain
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章,我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 f1dmPx051StA 2026-08-03 7/350 2026-08-04 09:31 by v1TJC4qJauAB
[博后之家] 售SCI-T0P文章,我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 jRl3mE6ddZGq 2026-08-03 5/250 2026-08-04 09:27 by v1TJC4qJauAB
[教师之家] 售SCI一区文章,我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +5 cu9Nq1xK233Z 2026-08-03 10/500 2026-08-04 09:15 by v1TJC4qJauAB
[基金申请] 系统今天又提示维护了,估计离放榜不远了 +12 winnerche 2026-07-29 16/800 2026-08-04 08:18 by Equinoxhua
[有机交流] 一个有机合成实验室都需要哪些设备? 50+3 kf2781974 2026-07-31 10/500 2026-08-04 08:05 by 88817753
[找工作] 售SCI一区文章,我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 cu9Nq1xK233Z 2026-08-03 9/450 2026-08-04 07:37 by k7OM8YghWbkC
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章,我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 cu9Nq1xK233Z 2026-08-03 13/650 2026-08-04 07:30 by k7OM8YghWbkC
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章,我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 jRl3mE6ddZGq 2026-08-03 6/300 2026-08-04 04:47 by k7OM8YghWbkC
[公派出国] 售SCI一区文章,我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 cu9Nq1xK233Z 2026-08-03 7/350 2026-08-04 04:46 by k7OM8YghWbkC
[高分子] UV压敏胶开发 +3 ichall 2026-07-30 5/250 2026-08-03 14:40 by Sunrisepay
[基金申请] 面上再次挂了,太难了,躺也躺不了,倦也卷不过,小学校之殇! +19 低垂的野花 2026-07-31 25/1250 2026-08-03 09:25 by gy116024
[基金申请] 微信指数没变化,科研之友没阅读 +15 wangze12014 2026-07-28 19/950 2026-08-02 20:05 by 蔡棒棒菂
[考博] 2027年申博 50+3 射雕英雄胜 2026-07-30 3/150 2026-08-02 09:36 by lfy8008
信息提示
请填处理意见