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犁头狗

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 南海所老龚 at 2013-03-19 08:41:45
做不出来原因很多,得一个个对照排除。我前段时间也是一直做不出来,琢磨了好久,后来发现是氨苄的问题。
我认为你可以从以下几个方面来分析:
1)PCR产物(楼上也指出是不是酶的问题,或者扩增其他片段做克隆,看 ...

谢谢!
11楼2013-03-19 15:54:53
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犁头狗

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 虫子火箭兵 at 2013-03-18 22:41:49
载体的问题么?试试其他的对照  或者加点A试试

我用的是天跟的Mix,里面已经包括ATCG了,难道要额外添加一些A吗?
12楼2013-03-19 15:56:54
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tuodecai

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励应助! 2013-03-21 11:09:57
没得说,这肯定是Rp问题!  嘿嘿     按理来说,300多bp的片段不管连啥T载体   应该会长一满板的菌才对啊。难道你就长几个了,而且全是蓝的。不太可能吧?  其实几百bp的片段连T载体的话,就算不蓝白斑筛选的话,至少你10个克隆至少也有7-8个阳性克隆了。我连T载体的曾经连过10kb的,宝生物的18.19T连个5-6kb是没问题的  而且也不用过夜16度1-2小时就够了  像你这么长的  室温5分钟就够了。我看你应该是个新手吧?不管你浓度多大,连接比例多少,只要是你的片段带A,载体1u,片段4u,solutionI 5u.再转化没问题,保你长出来的挑都挑不完。至少80%是阳性克隆了。
13楼2013-03-20 14:16:48
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tuodecai

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
12楼: Originally posted by 犁头狗 at 2013-03-19 15:56:54
我用的是天跟的Mix,里面已经包括ATCG了,难道要额外添加一些A吗?...

用的mix  肯定不用再加dntp了
14楼2013-03-20 14:18:40
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zr281069

银虫 (小有名气)

我也做了同样的实验  也出现连不上去的结果
人物
15楼2013-03-20 20:58:17
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莓林塔

木虫 (小有名气)

同命相连的人我TA克隆已经做了至少20天了,今早又浪费了12个板子。。。我所有的东西都换过了还是不行。。。。就说出鬼了!!
16楼2013-05-19 13:21:46
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zfj20110603

金虫 (小有名气)

引用回帖:
13楼: Originally posted by tuodecai at 2013-03-20 14:16:48
没得说,这肯定是Rp问题!  嘿嘿     按理来说,300多bp的片段不管连啥T载体   应该会长一满板的菌才对啊。难道你就长几个了,而且全是蓝的。不太可能吧?  其实几百bp的片段连T载体的话,就算不蓝白斑筛选的话,至 ...

10kb连T载体,你是怎么连的呀?是PCR扩增10KB吗?用什么酶扩增的呀?
17楼2013-05-30 13:26:02
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20083630zhan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你测浓度的时候260/280的比值是多少,有可能是你回收的DNA不是很纯,里面带有乙醇。再者就是你片段与载体的连接比例的问题。
18楼2013-05-30 13:46:11
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tuodecai

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
17楼: Originally posted by zfj20110603 at 2013-05-30 13:26:02
10kb连T载体,你是怎么连的呀?是PCR扩增10KB吗?用什么酶扩增的呀?...

其实像这种T载体(质粒载体)一般插入个10kb,基本上已经是极限了,再大也就一稳定了。我的10kb片段是PCR扩增的,扩这么长的片段的酶可多了,基本上每个公司都有的。不过得看保真性,若是不看保真性,就看扩增长度的话,有的长片段酶都可以扩40多kb了。
19楼2013-05-31 23:53:59
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wjzpwyz

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

连接时间不要过夜,按照按照说明书上的时间连,如果T载体质量不好,过夜往往会把t载体变成平末端这样就都自连了
20楼2013-06-02 19:40:15
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