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犁头狗

新虫 (初入文坛)

[求助] T-A克隆一直做不出来

片段345bp,用Taq酶扩增纯化后测得浓度为49.3ng/ul,用Takara pmd 19-T simple vector试剂盒连接,严格按照说明书操作,感受态细胞为DH5a,蓝白斑筛选结果 阴性对照没有菌落,阳性对照均为白色菌落,但是实验平板上却全是蓝色菌落,重复三次结果都一样,不知道原因在哪啊?
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tuodecai

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
17楼: Originally posted by zfj20110603 at 2013-05-30 13:26:02
10kb连T载体,你是怎么连的呀?是PCR扩增10KB吗?用什么酶扩增的呀?...

其实像这种T载体(质粒载体)一般插入个10kb,基本上已经是极限了,再大也就一稳定了。我的10kb片段是PCR扩增的,扩这么长的片段的酶可多了,基本上每个公司都有的。不过得看保真性,若是不看保真性,就看扩增长度的话,有的长片段酶都可以扩40多kb了。
19楼2013-05-31 23:53:59
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liyu0355

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-03-18 18:04:11
实验平板上却全是蓝色菌落,说明片段没连上.

Vector DNA和Insert DNA的摩尔比一般为:1:2~10。

你连接时间是多久呢??

我们实验室通常连接过夜呢.
2楼2013-03-17 22:59:20
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犁头狗

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by liyu0355 at 2013-03-17 22:59:20
实验平板上却全是蓝色菌落,说明片段没连上.

Vector DNA和Insert DNA的摩尔比一般为:1:2~10。

你连接时间是多久呢??

我们实验室通常连接过夜呢.

我也是连接过夜的
3楼2013-03-17 23:07:57
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j2

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
用的什么酶扩增的?高保增需要加A的

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
修炼ing,当虫仙……
4楼2013-03-18 09:02:48
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