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T-A克隆一直做不出来
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| 片段345bp，用Taq酶扩增纯化后测得浓度为49.3ng/ul，用Takara pmd 19-T simple vector试剂盒连接，严格按照说明书操作，感受态细胞为DH5a，蓝白斑筛选结果 阴性对照没有菌落，阳性对照均为白色菌落，但是实验平板上却全是蓝色菌落，重复三次结果都一样，不知道原因在哪啊？ |
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4楼2013-03-18 09:02:48
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skywards
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6楼2013-03-18 12:17:34
Renavatio
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7楼2013-03-18 15:43:24
8楼2013-03-18 22:41:49
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做不出来原因很多，得一个个对照排除。我前段时间也是一直做不出来，琢磨了好久，后来发现是氨苄的问题。 我认为你可以从以下几个方面来分析： 1）PCR产物（楼上也指出是不是酶的问题，或者扩增其他片段做克隆，看有无类似的结果） 2）连接载体 3）感受态（我们课题组发现有些公司的感受态分批次，有时候整一批感受态都不好用，你可以换其他公司产品试试） 4）如果在操作上没问题，也就是说你以前用同样的操作做出来克隆的话，那就重点考虑以上3点。个人意见，仅供参考，祝顺利！ |
9楼2013-03-19 08:41:45
10楼2013-03-19 15:53:18
tuodecai
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| 没得说，这肯定是Rp问题！ 嘿嘿 按理来说，300多bp的片段不管连啥T载体 应该会长一满板的菌才对啊。难道你就长几个了，而且全是蓝的。不太可能吧？ 其实几百bp的片段连T载体的话，就算不蓝白斑筛选的话，至少你10个克隆至少也有7-8个阳性克隆了。我连T载体的曾经连过10kb的，宝生物的18.19T连个5-6kb是没问题的 而且也不用过夜16度1-2小时就够了 像你这么长的 室温5分钟就够了。我看你应该是个新手吧？不管你浓度多大，连接比例多少，只要是你的片段带A，载体1u,片段4u，solutionI 5u.再转化没问题，保你长出来的挑都挑不完。至少80%是阳性克隆了。 |
13楼2013-03-20 14:16:48
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