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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » T-A克隆一直做不出来
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犁头狗

新虫 (初入文坛)

[求助] T-A克隆一直做不出来

片段345bp，用Taq酶扩增纯化后测得浓度为49.3ng/ul，用Takara pmd 19-T simple vector试剂盒连接，严格按照说明书操作，感受态细胞为DH5a，蓝白斑筛选结果 阴性对照没有菌落，阳性对照均为白色菌落，但是实验平板上却全是蓝色菌落，重复三次结果都一样，不知道原因在哪啊？
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1楼 2013-03-17 22:37:27
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skywards

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-06-01 11:08:22
可以随机挑取几个蓝色菌落用PCR鉴定一下，因为插入片度大小因素也会导致克隆成功但呈现的是蓝色菌落的。
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6楼2013-03-18 12:17:34
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liyu0355

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-03-18 18:04:11
实验平板上却全是蓝色菌落,说明片段没连上.

Vector DNA和Insert DNA的摩尔比一般为：1：2～10。

你连接时间是多久呢??

我们实验室通常连接过夜呢.
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2楼2013-03-17 22:59:20
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犁头狗

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by liyu0355 at 2013-03-17 22:59:20
实验平板上却全是蓝色菌落,说明片段没连上.

Vector DNA和Insert DNA的摩尔比一般为：1：2～10。

你连接时间是多久呢??

我们实验室通常连接过夜呢.

我也是连接过夜的
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3楼2013-03-17 23:07:57
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j2

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用的什么酶扩增的？高保增需要加A的

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下(1人) 回复此楼
修炼ｉｎｇ，当虫仙……
4楼2013-03-18 09:02:48
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