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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助苯酚氯仿发提取DNA
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fbcf7f7

木虫 (著名写手)

[求助] 求助苯酚氯仿发提取DNA

样品为粪便和菌液，准备做DGGE用，但是上次用这个方法同批次的差异很大，有的条带很亮，有的很暗，还有的没有，想请大家帮忙看一下，在70%乙醇洗涤时应该注意什么？个人认为这一步可能DNA损失很大
谢谢啦
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1楼 2013-01-06 22:18:16
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
fbcf7f7: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-01-07 09:16:34
fbcf7f7: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-01-07 09:18:20
70%的乙醇是洗去多余的盐，应该没什么损失吧。这一步一般就是用手指轻轻把沉淀弹起来，然后就去离心了。你所说的差异大能否上个图看看？
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2楼2013-01-07 03:03:00
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fbcf7f7

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-07 03:03:00
70%的乙醇是洗去多余的盐，应该没什么损失吧。这一步一般就是用手指轻轻把沉淀弹起来，然后就去离心了。你所说的差异大能否上个图看看？

图没有拍下来，就是同批次提取的样品PCR后有的条带很亮，有的条带暗，还有的几乎看不到
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3楼2013-01-07 09:18:01
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by fbcf7f7 at 2013-01-07 09:18:01
图没有拍下来，就是同批次提取的样品PCR后有的条带很亮，有的条带暗，还有的几乎看不到...

PCR的结果不能直接说明总DNA的量。提DNA的损失主要是在裂解完成度和酚氯仿抽提，应该和乙醇洗没太直接关系。PCR时模板浓度需要在一个范围才能有效地扩增，如果模板太多有时候反而P不出来。
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4楼2013-01-07 11:13:46
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fbcf7f7

木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-07 11:13:46
PCR的结果不能直接说明总DNA的量。提DNA的损失主要是在裂解完成度和酚氯仿抽提，应该和乙醇洗没太直接关系。PCR时模板浓度需要在一个范围才能有效地扩增，如果模板太多有时候反而P不出来。...

那请问一下有什么好的办法呢？谢谢啦！
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5楼2013-01-07 14:31:44
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
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5楼: Originally posted by fbcf7f7 at 2013-01-07 14:31:44
那请问一下有什么好的办法呢？谢谢啦！...

DNA提完后可以定浓度，也可以跑胶看。但如果样品RNA消化不完全的话，会干扰浓度测定。
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6楼2013-01-07 14:42:38
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fbcf7f7

木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-07 14:42:38
DNA提完后可以定浓度，也可以跑胶看。但如果样品RNA消化不完全的话，会干扰浓度测定。...

我用分光光度计大概扫了一下OD260/OD280大概在1.3左右
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7楼2013-01-07 14:54:23
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fbcf7f7

木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-07 14:42:38
DNA提完后可以定浓度，也可以跑胶看。但如果样品RNA消化不完全的话，会干扰浓度测定。...

再麻烦问一句，如果直接进行菌液PCR效果会怎么样？
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8楼2013-01-07 21:25:37
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
7楼: Originally posted by fbcf7f7 at 2013-01-07 14:54:23
我用分光光度计大概扫了一下OD260/OD280大概在1.3左右...

比值太低，说明有蛋白污染。一般干净的DNA样品A260/280在1.75-1.85之间。直接用菌液PCR也可以的，不过模板可能比较脏，毕竟没有除去蛋白和RNA。而且要注意少加菌，否则可能P出杂带。
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9楼2013-01-08 07:26:00
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fbcf7f7

木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-08 07:26:00
比值太低，说明有蛋白污染。一般干净的DNA样品A260/280在1.75-1.85之间。直接用菌液PCR也可以的，不过模板可能比较脏，毕竟没有除去蛋白和RNA。而且要注意少加菌，否则可能P出杂带。...

谢谢啦
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10楼2013-01-08 12:18:19
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