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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助：酚氯仿抽提的DNA，吸光曲线峰值总是在270nm附近
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在路上ing

银虫 (小有名气)

[求助] 求助：酚氯仿抽提的DNA，吸光曲线峰值总是在270nm附近

各位坛友，我用酚氯仿提的DNA，用NaNo DROP 1000 Spectrophotometer分光光度计检测，其吸收曲线峰值总是在270nm附近，提示有明显的苯酚污染！
    我用的酚是pH8.0左右的Tris饱和酚，抽吸的时候吸的是下层的苯酚，黄色的，未变质。
    我的操作习惯一般是用等体积酚抽一次，离心后取上清再用等体积氯仿异戊醇（24:1）抽提一次，然后用2倍体积无水乙醇或是1倍体积异丙醇沉淀，然后70%乙醇洗涤2-3次，结果总是如上所述，很糟糕。。。
    先加1/2体积苯酚，然后不离心抽上清而是直接加1/2体积氯仿异戊醇（24:1）或者直接加入混好的25:24:1的商品化的酚氯仿异戊醇也试过了，结果基本同上。。。
    加入有机溶剂后的混匀：之前我都是用转速可调的漩涡振荡器1300rpm混匀（之前看过一篇文献，作者使用的是800rpm混匀，我在使用该转速时，发现混匀效果并不理想--没有出现有机相与水相混匀后呈现的乳状浑浊液，我将转速逐步上调后，发现1300rpm效果不错）；后来还试过手摇颠倒混匀；最近由于担心此骤与苯酚残留有关，只是轻轻地翻转EP管4-6次，每次翻转都使两相混匀成乳状浑浊液了！结果我提出来的DNA的吸光曲线峰值仍然在270nm附近！
    最近两次抽提我在加入有机溶剂后抽上清时特意只抽了2/3-3/4的上清，舍弃了相当一部分上清，结果仍然没有改善！
    有网友曾说过对于苯酚残留“多次 70% 乙醇洗涤也可以达到满意的效果”，我也按照网友建议的手法洗涤的：离心--倒上清--再离心--抽出残余上清，并且重复了该洗涤步骤2次。结果依旧。。。
    提了很久了，一直是这样，换试剂或者换人做也都试过，一直没解决这个问题。。。
    由于我是做一个方法比较，而酚氯仿纯化是之前的研究者都一致采用的纯化方法，我即使想给出我改进的其他纯化方法也要先重复出前人的结果以供参照比较。在目前的这种情况下，苯酚残留应该是明显可见的，所以提取的纯度肯定是不理想的。这种吸光曲线其核酸定量值肯定是不可信的。所以这个问题是不得不解决的！
    还请有经验的坛友给予指点，小生不胜感激！
PS：我用该方法提取的DNA经分光光度计检测，其260/280分布范围很广：1.38-2.07，一半以上分布在1.5-1.8；     
    260/230的分布范围更宽：1-2.1都有。但是在吸收曲线峰值在270nm附近徘徊时，该比值有意义嘛？
    有网友还曾在帖子中写道“甚至使用氯仿抽提一次就可以了”。这种方法我也尝试过，效果不错，大部分产物的吸光曲线峰值都是在260nm。只是有两三个样本的峰值在258或259nm处。只是心中仍有疑问：为什么大家公认的经典的酚氯仿抽提纯化到了我手上却总是这种结果？难道真是RP问题？但是我自认为我RP不差啊，身边的同学朋友也都这么认为>_<
附上我选取的几张酚氯仿纯化的DNA的吸光曲线照片。我的目的DNA含量不高（保存在20μl体系中，含量＜50ng/μl），所以曲线形状不漂亮，各位坛友莫见笑>_<
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爹娘啊，爹娘，我是你们长不大的儿郎
1楼 2011-10-07 11:12:54
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longrna

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 不给EPI就对不住了！确实，加氯仿后不剧烈震荡是混不好的！ 2011-11-17 19:04:52
再仔细看了一下你的操作，加入有机溶剂（氯仿）抽提时“轻轻地翻转EP管4-6次，每次翻转都使两相混匀成乳状浑浊液了”  不可能吧？ 哪有那么容易轻轻翻转一下就两相混匀的了？

如果你要求的基因组并不是极高的完整性，建议拇指支持住EP管底，食指紧握EP管盖，猛烈的或尽你所能最快速的上下剧烈晃动30-60s. 我试过提出来的DNA并不会断裂很明显，>23k是没问题的。但如果你真的要求提到的基因组>100kb的勿试....很多人都是怕会搞断DNA，其实DNA并没有想像中那么脆弱。
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伟大航线....
9楼2011-11-17 10:53:19
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普通回帖

西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
1949stone(金币+2): 鼓励 2011-10-07 23:32:25
在路上ing(金币+2): 我也这么试过，但曲线峰值仍然偏离260nm处好几个nm。我再试试吧！感谢回复！ 2011-10-08 15:19:59
酚在水中是微溶的，但是能被氯仿抽提到有机相中。我在好几个实验室做的都是先用酚氯仿异戊醇（直接买的混好的）抽提一次，然后再用单独的氯仿抽提一次，没出现过苯酚残留的情况呢。
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2楼2011-10-07 18:07:43
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大孙20111987

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

在路上ing(金币+1): 我用70%乙醇洗了三次效果仍然不理想的。我再多试试吧。感谢回复！ 2011-10-08 15:21:13
用无水乙醇洗洗  再测测呢
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做好自己，坚持到底
3楼2011-10-07 21:33:01
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xlwlqh

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

在路上ing(金币+1): 呵呵，同病相怜啊。我后来就干脆只用氯仿和异戊醇抽提了，效果还可以，只是峰值总在258nm附近。 2011-11-16 22:24:02
楼主你好，请问你现在DNA提的怎么样了？我现在和你一样，想向你咨询一下，我的QQ446280827，谢谢。
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4楼2011-11-10 11:49:48
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75372017

木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

在路上ing(金币+1): 谢谢建议。我实在是头大了，所以干脆就不用苯酚了。感觉苯酚的溶解性和吸光系数都很强大！ 2011-11-16 22:25:19
在沉淀前试试用等量氯仿洗一次，也许会有效果
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5楼2011-11-10 14:28:13
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zy4315456

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
wanhscn(金币+3): good!鼓励交流! 2011-11-11 11:54:07
不知道你的样品是什么，我也遇到过一样的问题，个人感觉应该跟样品有关，跟抽提步骤关系不是很大。我开始使用的方法是CTAB，后来改用TN150，有一定的缓解。吸光度值在260左右。
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在路上ing
6楼2011-11-11 11:11:03
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在路上ing

银虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by zy4315456 at 2011-11-11 11:11:03:
不知道你的样品是什么，我也遇到过一样的问题，个人感觉应该跟样品有关，跟抽提步骤关系不是很大。我开始使用的方法是CTAB，后来改用TN150，有一定的缓解。吸光度值在260左右。

谢谢你的建议。我感觉也是跟样品有关。想来想去我的实验中应该不会引入类似吸光特性的杂质。所以，我目前的结论是：跟样品含量有关。苯酚的水溶性虽然很弱，但是其吸光能力却很强。当DNA含量很高时，它的影响就不明显--被DNA的强吸收遮盖了；当DNA含量很少时，它的影响就显现出来了。
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爹娘啊，爹娘，我是你们长不大的儿郎
7楼2011-11-16 22:29:54
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longrna

新虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4): Good! 2011-11-17 19:03:24
NanoDrop 1000个人认为其读数在0-30甚至40间的读数太小，不可信，所以其比值也不可信，更不要说260/230,260/280了。

试过用Trizol提RNA当样品所提的浓度很低时，其也是像楼主所说的这种情况。大多数认为270有吸光是有酚污染。不过我觉得如果可以先把样品的浓度提上去，使其所测浓度>50ng/ul，再来看操作上的问题。所以从某种程序上说也可以理解成样品问题。

另外，酚后一般会使用氯仿再抽一次，混匀要充分，时间可久一点。
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伟大航线....
8楼2011-11-17 10:41:13
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longrna

新虫 (正式写手)
弱弱问一下：西瓜是谁啊？ MolEPI什么EPI的又是啥啊？
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伟大航线....
10楼2011-11-17 19:55:33
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