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hwchen2000

金虫 (正式写手)

[求助] RT-PCR高手请进

请高手们帮我看看RT-PCR的电泳图，给点建议
图2中箭头所指是曾经得到的产物，但是之后再也没有重复到，图1是PCR和第二轮PCR结果

图片1.jpg

图片2.jpg



[ Last edited by hwchen2000 on 2013-1-2 at 11:05 ]
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1楼 2013-01-02 11:03:24
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你得到的片段太不明显，很没有说服力，建议你重新设计引物。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2013-01-02 17:27:39
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zhang881007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议你使用梯度TM温度，再做RT-PCR试试
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shine
3楼2013-01-04 16:59:11
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huiniss

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主的RT-PCR没有做出来，首先要确定产物的大小，和标准条带对比看看是否扩增出来了，从两个图看，根本没有扩增出来。如果已经重复很多次了都是这样的话，建议重新开始：方法一、提取mRNA时先跑个琼脂糖快速电泳看看是否出现2或3个条带，出现的话说明mRNA这一步没有问题；方法二、换成随机引物做PCR扩增，如果出现明显条带就说明楼主的引物设计有问题，如果不出现条带说明可能是mRNA降解了压根就没有成功合成过cDNA。
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hwchen2000
4楼2013-01-04 17:53:46
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hwchen2000

金虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by huiniss at 2013-01-04 17:53:46
楼主的RT-PCR没有做出来，首先要确定产物的大小，和标准条带对比看看是否扩增出来了，从两个图看，根本没有扩增出来。如果已经重复很多次了都是这样的话，建议重新开始：方法一、提取mRNA时先跑个琼脂糖快速电泳看看 ...

mRNA跑过胶的，没有问题
现在的想法可能是引物的问题，因为我是用玉米等主要作物的同源序列设计的引物，目标植物是木本森林植物，可能物种之间的亲缘关系的问题造成引物不合适，所以现在想重新设计引物
谢谢你！
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5楼2013-01-07 20:52:12
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