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大肠杆菌转化
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| 最近在做载体构建、转化大肠杆菌的实验，具体流程是先准备好pMD19T-A与pET-28a载体，我要将A插入pET-28a做表达，两个载体同时酶切，回收目的条带，酶联过夜，转化DH5a感受态细胞。现在问题是，转化子长了挺多，但是有大有小，挑几个做菌落PC鉴定，有目的大小的条带，但是有时候弱，有时候强，然后活化菌提质粒，电泳结果是条带有时候大小不正确，有时候干脆没有。后来还发现转化子的平板在室温下放置2天，菌落就会长的很大，像是酵母。重复了很多次，换了限制性内切酶、连接酶、感受态细胞，但是最终还是失败，请各位同行赐教，万分感谢！ |
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9楼2012-12-30 13:33:03
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【答案】应助回帖
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长大小不一的菌落，应该是染杂菌了 可能是感受态染杂菌了，换新做的，做的时候仔细些，或者多挑几个（六个菌落左右）在一个管子里面摇菌，因为感受态是在无菌培养基中培养，没有抗性，多挑几个利用种群竞争来抗下杂菌生长，或者直接去买感受态 也可能是做转化过程染菌了，建议在 超净台操作 还可能是抗生素失效了，或者部分失效，导致有小菌落的杂菌生长，建议换抗生素或者加大抗生素浓度 至于平板在室温下长得很大应该是正常的，一般都储层在4度左右，室温25度，大肠杆菌的繁殖速度还是很快的 |
4楼2012-12-29 14:02:52
