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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 多个基因共表达纯化问题
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coh2lxx

银虫 (小有名气)

[求助] 多个基因共表达纯化问题

请教共表达两个基因以及表达后如何纯化。具体为
两个基因都有完整阅读框，之间加有rbs，如何连接到pet28，能实现共表达吗？
另外，就是如果共表达了，第一个蛋白可以利用载体的His标签纯化，那第二个也能纯化吗？如果不能，是不是应该在它前面加上His标签呢？
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1楼 2012-11-29 11:38:34
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
引用回帖:
5楼: Originally posted by coh2lxx at 2012-11-29 15:12:45
第一基因前需不需要加裂解位点洗脱目的蛋白？
如果我要在第二个基因前加his，是不是还要加裂解位点，便于纯化时洗脱目标蛋白呢？...

裂解位点?是什么？你是指蛋白纯化后，切除his标签的酶切位点吗？
我没那么做过，主要是切蛋白的酶太贵了。
如果担心标签对酶的催化活性有影响，我们一般会做两组连接，一组是基因带标签用于蛋白纯化和体外酶活测定，一组是基因不带标签，直接用于体内催化转化。
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Thank-you，so-blue.
6楼2012-11-29 15:57:17
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coh2lxx

银虫 (小有名气)
自己顶一下，有懂的大侠帮帮忙！！！
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2楼2012-11-29 11:43:58
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
coh2lxx: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-11-29 15:04:35
coh2lxx: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-11-29 20:47:18
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-12-03 16:35:52
1、连接的话，先连接A基因到pet28，B基因借助另外一个载体，连接后，扩增RBS-B基因进行第二次连接；
2、T7启动子共表达两个基因没问题。
3、共表达主要是做催化用的，做纯化没必要共表达吧。分开表达纯化不是更好？
如果确实像同时纯化也行，在扩增第二个基因的引物上加上his标签就行。
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Thank-you，so-blue.
3楼2012-11-29 13:55:08
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coh2lxx

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by susizheng at 2012-11-29 13:55:08
1、连接的话，先连接A基因到pet28，B基因借助另外一个载体，连接后，扩增RBS-B基因进行第二次连接；
2、T7启动子共表达两个基因没问题。
3、共表达主要是做催化用的，做纯化没必要共表达吧。分开表达纯化不是更好 ...

谢谢您的建议。
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4楼2012-11-29 15:04:24
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