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clflying

金虫 (初入文坛)

[求助] PCR问题求助！

提出的基因组进行PCR，至今无法出条带，温度梯度和浓度梯度都做了，之前用师兄做好的重组质粒来P是能够P出来的，引物和条件都是一样的，区别就是一个用的是重组质粒，一个用的是提出的基因组，但是基因组已经提过3次，试剂也都换了新的，不知道什么原因，请教各位大神！
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1楼 2012-11-21 15:01:19
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8171532

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
clflying: 金币+2, ★有帮助 2012-11-22 16:50:11
我觉得你要先确定一下你提的基因组有没有问题
各个条件都摸索了依然没结果，你试试取pcr后产物做模板再p一次，有的时候第一次没p出来，第二次就p出来了
还是出不来的话，如果你要的目的片段比较小的话，可以试试先P一段较长的序列，在此基础上再P你的目的条带
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2楼2012-11-21 15:27:51
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phoenix2

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
clflying: 金币+2, 博学EPI+1, ★有帮助, 谢谢。 2012-11-22 16:48:14
基因组扩PCR首先就是要注意浓度问题，基因组浓度不能太高，一般我们用试剂盒提出来以后都会稀释100-300倍，再用作模板，2就是内含子问题，基因组有内含子，看看内含子有多长，内含子过大也会影响PCR结果，3重组质粒相对浓度很高的，所以可能比较好P，可以试试2次PCR，4GC含量也是个问题，你可以试试GC buffer I,II, 再搭配相应的酶试试。不知道能不能帮到你。
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3楼2012-11-21 17:15:59
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savmpaso

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

还有酶的问题，我当初扩一个大片段，用普通的Taq酶就不行，换成longTaq成功率就高了
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4楼2012-11-22 09:36:42
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