应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 基因引物与内参引物
151/2返回列表12下一页
查看: 3217  |  回复: 14
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

Road2011

银虫 (小有名气)

[求助] 基因引物与内参引物

做qRT-PCR时，1.目的基因引物是25base,根据估计是191bp,试用于做qRT-PCR不？2.内参引物选择20base的B-actin与选择25base的GAPDH,影响不？现在已经买了20base的B-actin，不知道能用不？
谢谢
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-11-05 11:06:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
Road2011: 金币+1, ★★★很有帮助, 谢谢 2012-11-05 14:50:58
退火温度怎么样？合成的引物做过溶解曲线，扩增效率等的检测吗？上机器试一下
赞一下 回复此楼
jiayoubashaonian
2楼2012-11-05 11:15:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Road2011: 金币+1, ★★★很有帮助, 谢谢 2012-11-05 15:26:04
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-11-06 17:20:34
目的基因引物和内参引物的退火温度要大致相同以便同时检测。还有就是扩增片段大小最好也大致一样保证反转录时的效率相同。最重要的是，引物不形成稳定的二级结构和引物二聚体。
赞一下 回复此楼
3楼2012-11-05 13:48:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Road2011

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by blackrose8089 at 2012-11-05 11:15:04
退火温度怎么样？合成的引物做过溶解曲线，扩增效率等的检测吗？上机器试一下

B-actin引物是买回来的，测qRT-PCR时候的CT值大约是20oC。扩增效率怎么检测啊？谢谢
赞一下 回复此楼
4楼2012-11-05 14:50:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Road2011

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-05 13:48:45
目的基因引物和内参引物的退火温度要大致相同以便同时检测。还有就是扩增片段大小最好也大致一样保证反转录时的效率相同。最重要的是，引物不形成稳定的二级结构和引物二聚体。

如何知道退火温度呢？
赞一下 回复此楼
5楼2012-11-05 15:26:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Road2011 at 2012-11-05 14:50:35
B-actin引物是买回来的，测qRT-PCR时候的CT值大约是20oC。扩增效率怎么检测啊？谢谢...

相对定量，Ct值是阈值，qPCR的循环数，扩增效率采用梯度稀释方法PCR
赞一下 回复此楼
jiayoubashaonian
6楼2012-11-05 16:35:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-11-06 17:20:47
Road2011: 金币+1 2012-11-17 17:03:09
引用回帖:
5楼: Originally posted by Road2011 at 2012-11-05 15:26:43
如何知道退火温度呢？...

根据引物的序列，很多软件都可以计算Tm值的，也可以粗略估算4*（G+C）+ 2*(A+T)。PCR时选取的退火温度为Tm值-3~5°C。但做qPCR最好做个退火温度梯度以选取最佳退火温度。
赞一下 回复此楼
7楼2012-11-06 10:44:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

494750284

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-11-08 13:54:55
Road2011: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢 2012-11-17 17:03:25
1、内参选择actin与gapdh没啥区别，housekeeper嘛
2、想看引物合格与否，首先要看反应条件是否一致、引物扩增条带是否特异单一且无引物二聚体，其次是看其扩增效率。
3、磨刀不误砍柴工。看楼主以上的回答，发现，楼主对PCR的原理了解的很少。不如先花点时间弄明白PCR，以及在此基础上的real-time PCR
赞一下 回复此楼
8楼2012-11-06 22:37:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Road2011

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-05 13:48:45
目的基因引物和内参引物的退火温度要大致相同以便同时检测。还有就是扩增片段大小最好也大致一样保证反转录时的效率相同。最重要的是，引物不形成稳定的二级结构和引物二聚体。

反转录时，不是不用内参引物和目的基因引物吗，怎么就能效率相同呢？
赞一下 回复此楼
9楼2012-11-07 16:15:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by Road2011 at 2012-11-07 16:15:41
反转录时，不是不用内参引物和目的基因引物吗，怎么就能效率相同呢？...

如果扩增片段大小相差很多，反转录合成cDNA时较长的片段效率要低于小片段。进行qPCR时会造成一定的误差。
赞一下 回复此楼
10楼2012-11-08 07:49:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 Road2011 的主题更新
151/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 PbwVEMK5haaE 2026-08-25 5/250 2026-08-26 05:09 by cNXvBfCpiZOM
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 Qj98d49dHFb9 2026-08-25 5/250 2026-08-26 04:57 by cNXvBfCpiZOM
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 7K1CJE38xLG4 2026-08-25 4/200 2026-08-26 02:04 by cNXvBfCpiZOM
[基金申请] 有没有大神帮我看看基金代码 28+4 1234567wang 2026-08-24 10/500 2026-08-25 19:15 by lfy8008
[基金申请] 放榜前的不淡定 20+4 snowwithsea 2026-08-19 19/950 2026-08-25 17:57 by chick875
[基金申请] 某些机构，以效率低为荣，以效率低作为存在感 +9 yuleib84 2026-08-25 10/500 2026-08-25 17:14 by alexon
[基金申请] 2026国自然函评费到账 +20 羊腰板 2026-08-21 23/1150 2026-08-25 16:34 by zsna
[基金申请] 今日不放榜？网传国自然预计 8 月 27 日可查结果 +17 医学老男孩 2026-08-20 22/1100 2026-08-25 15:36 by 医学老男孩
[教师之家] 导师吐槽：我怎么摊上了这么个极品研究生！ +3 苏东坡二世 2026-08-23 3/150 2026-08-25 10:35 by shisan1313
[基金申请] 2026年的国家社科基金项目通讯评审的新规则与新动向、新挑战 +5 process2012 2026-08-23 7/350 2026-08-25 09:42 by huixian257
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +17 kkkl_v 2026-08-19 18/900 2026-08-25 09:41 by windflowerwy
[基金申请] filecode，4个jtjc了 +14 ziyangfang 2026-08-19 17/850 2026-08-24 18:37 by 哈哈蛤？
[基金申请] 建议基金发布提前给出明确的时间点 +13 kulium 2026-08-21 16/800 2026-08-24 16:27 by superceng
[基金申请] 让我中一个面上吧！ +13 大萍1987 2026-08-20 16/800 2026-08-24 10:23 by 太傻了
[基金申请] 科研孤儿太难了 +18 我4大白菜 2026-08-20 19/950 2026-08-24 09:47 by 凯恩广盛催化分�
[教师之家] 跳槽后在研项目怎么办？ +5 简单化xn 2026-08-22 10/500 2026-08-23 12:38 by 简单化xn
[基金申请] 今天放榜吗？ +15 布布和一二 2026-08-19 16/800 2026-08-23 09:55 by 张春生
[基金申请] 看来今天不会放榜了？ +8 chengyan1220 2026-08-21 11/550 2026-08-21 17:52 by dcqxinyang
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +9 yuleib84 2026-08-19 11/550 2026-08-21 10:06 by gltch
[基金申请] 基金啊基金 +4 longfie172 2026-08-20 4/200 2026-08-21 08:58 by mark mao
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭