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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 基因引物与内参引物
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Road2011

银虫 (小有名气)

[求助] 基因引物与内参引物

做qRT-PCR时，1.目的基因引物是25base,根据估计是191bp,试用于做qRT-PCR不？2.内参引物选择20base的B-actin与选择25base的GAPDH,影响不？现在已经买了20base的B-actin，不知道能用不？
谢谢
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1楼 2012-11-05 11:06:06
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
Road2011: 金币+1, ★★★很有帮助, 谢谢 2012-11-05 14:50:58
退火温度怎么样？合成的引物做过溶解曲线，扩增效率等的检测吗？上机器试一下
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jiayoubashaonian
2楼2012-11-05 11:15:04
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Road2011: 金币+1, ★★★很有帮助, 谢谢 2012-11-05 15:26:04
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-11-06 17:20:34
目的基因引物和内参引物的退火温度要大致相同以便同时检测。还有就是扩增片段大小最好也大致一样保证反转录时的效率相同。最重要的是，引物不形成稳定的二级结构和引物二聚体。
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3楼2012-11-05 13:48:45
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Road2011

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by blackrose8089 at 2012-11-05 11:15:04
退火温度怎么样？合成的引物做过溶解曲线，扩增效率等的检测吗？上机器试一下

B-actin引物是买回来的，测qRT-PCR时候的CT值大约是20oC。扩增效率怎么检测啊？谢谢
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4楼2012-11-05 14:50:35
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Road2011

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-05 13:48:45
目的基因引物和内参引物的退火温度要大致相同以便同时检测。还有就是扩增片段大小最好也大致一样保证反转录时的效率相同。最重要的是，引物不形成稳定的二级结构和引物二聚体。

如何知道退火温度呢？
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5楼2012-11-05 15:26:43
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Road2011 at 2012-11-05 14:50:35
B-actin引物是买回来的，测qRT-PCR时候的CT值大约是20oC。扩增效率怎么检测啊？谢谢...

相对定量，Ct值是阈值，qPCR的循环数，扩增效率采用梯度稀释方法PCR
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jiayoubashaonian
6楼2012-11-05 16:35:07
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-11-06 17:20:47
Road2011: 金币+1 2012-11-17 17:03:09
引用回帖:
5楼: Originally posted by Road2011 at 2012-11-05 15:26:43
如何知道退火温度呢？...

根据引物的序列，很多软件都可以计算Tm值的，也可以粗略估算4*（G+C）+ 2*(A+T)。PCR时选取的退火温度为Tm值-3~5°C。但做qPCR最好做个退火温度梯度以选取最佳退火温度。
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7楼2012-11-06 10:44:51
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494750284

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-11-08 13:54:55
Road2011: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢 2012-11-17 17:03:25
1、内参选择actin与gapdh没啥区别，housekeeper嘛
2、想看引物合格与否，首先要看反应条件是否一致、引物扩增条带是否特异单一且无引物二聚体，其次是看其扩增效率。
3、磨刀不误砍柴工。看楼主以上的回答，发现，楼主对PCR的原理了解的很少。不如先花点时间弄明白PCR，以及在此基础上的real-time PCR
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8楼2012-11-06 22:37:05
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Road2011

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-05 13:48:45
目的基因引物和内参引物的退火温度要大致相同以便同时检测。还有就是扩增片段大小最好也大致一样保证反转录时的效率相同。最重要的是，引物不形成稳定的二级结构和引物二聚体。

反转录时，不是不用内参引物和目的基因引物吗，怎么就能效率相同呢？
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9楼2012-11-07 16:15:41
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

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引用回帖:
9楼: Originally posted by Road2011 at 2012-11-07 16:15:41
反转录时，不是不用内参引物和目的基因引物吗，怎么就能效率相同呢？...

如果扩增片段大小相差很多，反转录合成cDNA时较长的片段效率要低于小片段。进行qPCR时会造成一定的误差。
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10楼2012-11-08 07:49:47
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