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Road2011

银虫 (小有名气)

[求助] 基因引物与内参引物

做qRT-PCR时,1.目的基因引物是25base,根据估计是191bp,试用于做qRT-PCR不?2.内参引物选择20base的B-actin与选择25base的GAPDH,影响不?现在已经买了20base的B-actin,不知道能用不?
谢谢
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494750284

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-11-08 13:54:55
Road2011: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢 2012-11-17 17:03:25
1、内参选择actin与gapdh没啥区别,housekeeper嘛
2、想看引物合格与否,首先要看反应条件是否一致、引物扩增条带是否特异单一且无引物二聚体,其次是看其扩增效率。
3、磨刀不误砍柴工。看楼主以上的回答,发现,楼主对PCR的原理了解的很少。不如先花点时间弄明白PCR,以及在此基础上的real-time PCR
8楼2012-11-06 22:37:05
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
Road2011: 金币+1, ★★★很有帮助, 谢谢 2012-11-05 14:50:58
退火温度怎么样?合成的引物做过溶解曲线,扩增效率等的检测吗?上机器试一下
jiayoubashaonian
2楼2012-11-05 11:15:04
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
Road2011: 金币+1, ★★★很有帮助, 谢谢 2012-11-05 15:26:04
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-11-06 17:20:34
目的基因引物和内参引物的退火温度要大致相同以便同时检测。还有就是扩增片段大小最好也大致一样保证反转录时的效率相同。最重要的是,引物不形成稳定的二级结构和引物二聚体。
3楼2012-11-05 13:48:45
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Road2011

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by blackrose8089 at 2012-11-05 11:15:04
退火温度怎么样?合成的引物做过溶解曲线,扩增效率等的检测吗?上机器试一下

B-actin引物是买回来的,测qRT-PCR时候的CT值大约是20oC。扩增效率怎么检测啊?谢谢
4楼2012-11-05 14:50:35
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