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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 急急急！诡异基因PCR扩不出来。。。
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tmoonday

金虫 (小有名气)

[求助] 急急急！诡异基因PCR扩不出来。。。

小弟最近在扩一基因，第一次试条件的时候扩出来了，但是其后在相同条件下，连续扩了3-4次都没扩出来，不过照胶时貌似有200-300bp片段出现（本人基因在1200-1300bp）,请问各位大牛，我应该怎么做哈？
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等一份缘分
1楼 2012-10-20 14:55:40
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水寒冰006

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
tmoonday: 金币+1, ★有帮助 2012-10-22 10:56:23
既然第一次能P出来，说明你的引物应该没有问题，先确保你的酶没有失效，体系没有问题，先试试吧，做个阳性对照。还有你可以拿你之前扩增出来的片段继续P
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2楼2012-10-20 17:47:40
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tulip1213

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
考虑换模板，重做。如果第一次使用高保真扩的，用此产物做模板吧
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3楼2012-10-20 19:28:02
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tmoonday

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by tulip1213 at 2012-10-20 19:28:02
考虑换模板，重做。如果第一次使用高保真扩的，用此产物做模板吧

我用第一次扩出来的为模板也没扩出来
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等一份缘分
4楼2012-10-21 09:20:46
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tmoonday

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 水寒冰006 at 2012-10-20 17:47:40
既然第一次能P出来，说明你的引物应该没有问题，先确保你的酶没有失效，体系没有问题，先试试吧，做个阳性对照。还有你可以拿你之前扩增出来的片段继续P

我用的50ul体系，40ulddH2O,buffer5ul,其它1ul
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等一份缘分
5楼2012-10-21 09:22:03
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tulip1213

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by tmoonday at 2012-10-21 09:20:46
我用第一次扩出来的为模板也没扩出来...

模板要稀释的，重新逆转录吧，高保真酶的产物容易降解。放一天产物就降解
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6楼2012-10-21 10:24:56
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niena

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by tulip1213 at 2012-10-21 10:24:56
模板要稀释的，重新逆转录吧，高保真酶的产物容易降解。放一天产物就降解...

我遇到了同样的情况，目标条带1kb,但扩增出来的200-400bp,我做了梯度，结果也是这样，用的是phusion酶
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7楼2012-10-22 14:39:38
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