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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于RT-PCR中逆转录试剂盒的问题！
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czcpudai

铜虫 (正式写手)

[求助] 关于RT-PCR中逆转录试剂盒的问题！

各位做过逆转录的高手们，本人在2012年6月20日购买到RT试剂盒，到现在快有5个月了，8月份才开始使用。在8月份的时候做RT-PCR目的基因可以扩增出来，等到9月中旬的时候，一直扩增不出目的条带，检测RNAOD比值2.01，电泳效果完整性也比较好，5s不太亮。我想问一下各位，有没有可能是试剂盒中的逆转录酶的活力下降了，反复冻融后活力下降了？我买了后没有分装逆转录酶，只是用的时候从-20度取出来，放在冰盒上操作，再放回-20度。前后如此操作差不多有20次。原因是不是8月份的时候是夏天，气温挺高的（四大火炉之一），酶拿出来后温差太大，这样子，反复冻融操作出现活力下降了！？？ 请分析一下原因，谢谢了！
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1楼 2012-10-15 09:07:31
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
再追问一个问题，比如我现在使用的是Biouniquer的试剂盒（肯定比不过英俊和Takara等公司的），现在要想换一下逆转录酶，我想换Takara的逆转录酶，
请问这个可以和Biouniquer的试剂盒想匹配吗？？？ 有没有仁兄经历过这种情况的？？？
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2楼2012-10-15 09:15:19
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-10-15 13:53:06
你的酶都是在冰上操作的话问题应该不大。在-20度的时候酶的stock里有甘油，也不会冻上的，所以不存在冻融问题。只要你做的时候才把酶拿出冰箱，在冰盒上取用后迅速放回冰箱就可以了。你所谓的P不出来是指反转后的cDNA为模板，P不出目的基因还是P什么都没有呢？比如说内参什么的？还有就是你提的RNA是不是立即做了反转录，有没有反复冻融？你做的是什么物种，一般mRNA的半寿期是多少？
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3楼2012-10-15 09:26:25
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by czcpudai at 2012-10-15 09:15:19
再追问一个问题，比如我现在使用的是Biouniquer的试剂盒（肯定比不过英俊和Takara等公司的），现在要想换一下逆转录酶，我想换Takara的逆转录酶，
请问这个可以和Biouniquer的试剂盒想匹配吗？？？ 有没有仁兄经历 ...

公司间的试剂盒不能混搭。而且逆转录的protocol各个公司的也不完全一样。
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4楼2012-10-15 09:28:31
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-15 09:26:25
你的酶都是在冰上操作的话问题应该不大。在-20度的时候酶的stock里有甘油，也不会冻上的，所以不存在冻融问题。只要你做的时候才把酶拿出冰箱，在冰盒上取用后迅速放回冰箱就可以了。你所谓的P不出来是指反转后的cD ...

p不出来指反转后的cDNA为模板，P不出目的基因。当加入的酶的量是1ul的时候，内参都没有，当加入3ul的时候，才可以看见内参。我做的人晶状体上皮细胞。我所提取的RNA是立即进行了RT-PCR，没有反复冻融！ 一般mRNA的半寿期我们好像没有关注这个问题啊！  
我所用的试剂盒中有两种逆转录的方法，有一种需要进行65度5min的RNA变性，主要是破除mRNA的复杂的结构，但是我没有采用这种方法，我担心会有RNA的降解，就采取了另一种，不用65度5min的变性处理。不知道这个会不会产生什么影响！
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5楼2012-10-15 11:02:53
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by czcpudai at 2012-10-15 11:02:53
p不出来指反转后的cDNA为模板，P不出目的基因。当加入的酶的量是1ul的时候，内参都没有，当加入3ul的时候，才可以看见内参。我做的人晶状体上皮细胞。我所提取的RNA是立即进行了RT-PCR，没有反复冻融！ 一般mRNA的 ...

对于复杂的mRNA来说，例如你做的RNA是人的，最好要变性。否则逆转录的温度较低，复杂结构影响引物与模板结合，cDNA的合成效率降低。一般相对简单的RNA，如原核生物的可以不做变性这一步。
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6楼2012-10-15 13:04:22
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-15 13:04:22
对于复杂的mRNA来说，例如你做的RNA是人的，最好要变性。否则逆转录的温度较低，复杂结构影响引物与模板结合，cDNA的合成效率降低。一般相对简单的RNA，如原核生物的可以不做变性这一步。...

恩 有道理啊  不过我见到一位同事从人的Hepg2细胞中提取rna做RT-PCR的时候也没有使用这一步，照样可以将1500bp的目的片度扩增出来，试剂盒都是一样的，可能还有其他的原因吧。您说的也很有道理，谢谢了！
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7楼2012-10-15 13:28:26
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dmtxbb

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-17 14:48:37
这种很正常，我觉得
1、是改基因表达量就是低
2、消化或者反转过程降解了

消除的方法可以用内参基因扩一下，扩出来就是说明1，出不来就是2
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8楼2012-10-16 18:01:03
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tulip1213

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励积极交流问题 2012-10-17 14:48:48
有可能是RNA降解了，理论上RNA和cDNA放-80冰箱没问题，但是我发现放置不能超过一个月。RNA，跑电泳看不出啥，实际上还是降解的；最好做个逆转录，cDNA跑电泳检测完整性。总之，酶没有问题，是RNA的问题。帮同学做过逆转录，由于RNA样品是溶解在乙醇中寄过来的，第一次，没有及时处理，放了一个月，RT-PCR不成功；第二次寄过来，及时处理并逆转录，目的基因就被扩出来了。
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9楼2012-10-16 18:20:17
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by tulip1213 at 2012-10-16 18:20:17
有可能是RNA降解了，理论上RNA和cDNA放-80冰箱没问题，但是我发现放置不能超过一个月。RNA，跑电泳看不出啥，实际上还是降解的；最好做个逆转录，cDNA跑电泳检测完整性。总之，酶没有问题，是RNA的问题。帮同学做过 ...

谢谢！cDNA跑电泳怎么样检测其完整性？没听说过cDNA还要跑电泳的啊？电泳显示什么效果才说明cDNA是好的呢？？？
还有我想问一下，您的逆转录的试剂盒是哪家公司的？？谢谢！
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10楼2012-10-16 18:52:28
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