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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于RT-PCR中逆转录试剂盒的问题！
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zhangby2002

银虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by czcpudai at 2012-10-16 18:52:28
谢谢！cDNA跑电泳怎么样检测其完整性？没听说过cDNA还要跑电泳的啊？电泳显示什么效果才说明cDNA是好的呢？？？
还有我想问一下，您的逆转录的试剂盒是哪家公司的？？谢谢！...

反转好的cDNA用内参去P,如果出现内参条带，证明你反转结果很好。
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业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。
11楼2012-10-16 18:59:41
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by zhangby2002 at 2012-10-16 18:59:41
反转好的cDNA用内参去P,如果出现内参条带，证明你反转结果很好。...

恩 ，您说的是有道理的，可是现在连内参都没有哎，我觉得我RNA应该是没有问题，都提取了那么多了，一开始也总是认为RNA不好，但是测完OD比值和跑完电泳后，我觉得不是RNA问题了，可能问题就出在了反转录上。
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12楼2012-10-16 20:01:16
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zhangby2002

银虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by czcpudai at 2012-10-16 20:01:16
恩 ，您说的是有道理的，可是现在连内参都没有哎，我觉得我RNA应该是没有问题，都提取了那么多了，一开始也总是认为RNA不好，但是测完OD比值和跑完电泳后，我觉得不是RNA问题了，可能问题就出在了反转录上。...

我原来通常用18S和B-ACTIN，你可以合成，做分子必备的。祝成功
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业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。
13楼2012-10-17 10:19:49
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by zhangby2002 at 2012-10-16 18:59:41
反转好的cDNA用内参去P,如果出现内参条带，证明你反转结果很好。...

昨天P了一下，发现出来了内参基因，将TaqPlus酶的量加倍了。  但是电泳后感觉在内参下面还有模糊的条带，那个我觉得不是由于非特异性扩增引起的，还值得讨论一下，总之，非常感谢您！！
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14楼2012-10-17 11:07:00
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tulip1213

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-10-17 14:49:33
引用回帖:
10楼: Originally posted by czcpudai at 2012-10-16 18:52:28
谢谢！cDNA跑电泳怎么样检测其完整性？没听说过cDNA还要跑电泳的啊？电泳显示什么效果才说明cDNA是好的呢？？？
还有我想问一下，您的逆转录的试剂盒是哪家公司的？？谢谢！...

取3-5微升cDNA跑电泳，看一下条带的弥散情况，应该是从低分子量到高分子量分布均匀。我自己曾经有过类似你的经历，需要重新克隆基因。从-80冰箱取的RNA，跑电泳，看不出降解，但是P不出来，后来检测了cDNA,cDNA不完整。后来重提RNA的。
我用的酶是promega的，一向是对折销售的那款，要另外订RNA酶抑制剂。
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15楼2012-10-17 11:15:25
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tulip1213

银虫 (小有名气)
内参一般是组成表达的基因，内参P出来一定能p出目的基因？
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16楼2012-10-17 11:19:32
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by tulip1213 at 2012-10-17 11:15:25
取3-5微升cDNA跑电泳，看一下条带的弥散情况，应该是从低分子量到高分子量分布均匀。我自己曾经有过类似你的经历，需要重新克隆基因。从-80冰箱取的RNA，跑电泳，看不出降解，但是P不出来，后来检测了cDNA,cDNA不完 ...

恩 非常感谢！！！ 您的意思还是RNA出现了问题，我还是两个方面走走看，一是重新提取RNA；另外换一下逆转录酶试一试，谢谢！
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17楼2012-10-17 16:13:10
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by tulip1213 at 2012-10-17 11:19:32
内参一般是组成表达的基因，内参P出来一定能p出目的基因？

我觉得内参出来， 目的基因不一定会有的
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18楼2012-10-17 16:13:31
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Dr.G

新虫 (初入文坛)
TAKALA的试剂没有期望中的好，不要受伤了···
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19楼2013-12-19 22:00:54
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