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汕头大学海洋科学接受调剂
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czcpudai

铜虫 (正式写手)

[求助] 关于RT-PCR中逆转录试剂盒的问题!

各位做过逆转录的高手们,本人在2012年6月20日购买到RT试剂盒,到现在快有5个月了,8月份才开始使用。在8月份的时候做RT-PCR目的基因可以扩增出来,等到9月中旬的时候,一直扩增不出目的条带,检测RNAOD比值2.01,电泳效果完整性也比较好,5s不太亮。我想问一下各位,有没有可能是试剂盒中的逆转录酶的活力下降了,反复冻融后活力下降了?我买了后没有分装逆转录酶,只是用的时候从-20度取出来,放在冰盒上操作,再放回-20度。前后如此操作差不多有20次。原因是不是8月份的时候是夏天,气温挺高的(四大火炉之一),酶拿出来后温差太大,这样子,反复冻融操作出现活力下降了!?? 请分析一下原因,谢谢了!
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by czcpudai at 2012-10-15 11:02:53
p不出来指反转后的cDNA为模板,P不出目的基因。当加入的酶的量是1ul的时候,内参都没有,当加入3ul的时候,才可以看见内参。我做的人晶状体上皮细胞。我所提取的RNA是立即进行了RT-PCR,没有反复冻融! 一般mRNA的 ...

对于复杂的mRNA来说,例如你做的RNA是人的,最好要变性。否则逆转录的温度较低,复杂结构影响引物与模板结合,cDNA的合成效率降低。一般相对简单的RNA,如原核生物的可以不做变性这一步。
6楼2012-10-15 13:04:22
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czcpudai

铜虫 (正式写手)

再追问一个问题,比如我现在使用的是Biouniquer的试剂盒(肯定比不过英俊和Takara等公司的),现在要想换一下逆转录酶,我想换Takara的逆转录酶,
请问这个可以和Biouniquer的试剂盒想匹配吗??? 有没有仁兄经历过这种情况的???
2楼2012-10-15 09:15:19
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-10-15 13:53:06
你的酶都是在冰上操作的话问题应该不大。在-20度的时候酶的stock里有甘油,也不会冻上的,所以不存在冻融问题。只要你做的时候才把酶拿出冰箱,在冰盒上取用后迅速放回冰箱就可以了。你所谓的P不出来是指反转后的cDNA为模板,P不出目的基因还是P什么都没有呢?比如说内参什么的?还有就是你提的RNA是不是立即做了反转录,有没有反复冻融?你做的是什么物种,一般mRNA的半寿期是多少?
3楼2012-10-15 09:26:25
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by czcpudai at 2012-10-15 09:15:19
再追问一个问题,比如我现在使用的是Biouniquer的试剂盒(肯定比不过英俊和Takara等公司的),现在要想换一下逆转录酶,我想换Takara的逆转录酶,
请问这个可以和Biouniquer的试剂盒想匹配吗??? 有没有仁兄经历 ...

公司间的试剂盒不能混搭。而且逆转录的protocol各个公司的也不完全一样。
4楼2012-10-15 09:28:31
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