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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 如何设计引物扩增片段？做克隆的
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review

银虫 (著名写手)

[求助] 如何设计引物扩增片段？做克隆的

已知 cdna序列和cds序列。
想设计引物：pcr扩增片段---回收片段，加A---与载体连接----转化--提质粒等
请问如何设计引物？是不是还要找到cds的  起始密码  终止密码之类？
谁能详细告诉我？初学者的困惑很痛苦啊
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交流
1楼 2012-09-29 13:42:13
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

wangqi20092

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
review: 金币+2, 谢谢！ 2012-10-08 13:13:07
肯定要在CDS区设计，要不然表达的也不是你要的蛋白，如果是原核表达的话还要考虑不能移码突变，如果要定位还要考虑终止密码子要不要。oligo设计比较好用。自己学怎么设计！！！
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11楼2012-10-04 12:29:21
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普通回帖

xw19880905

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-01 20:01:18
review: 金币+2, 谢谢！ 2012-10-08 13:13:23
这个没什么特别的呀，不需要起始密码终止密码子，你的上下游引物就是起始终止的作用，你要注意的是你设计的那段扩增片段是不是特异的，就按普通pcr引物设计一样设计引物
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2楼2012-09-29 15:20:05
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baby1987

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
review: 金币+2, 谢谢！ 2012-10-08 13:13:36
学习一下那个DNAman软件，primer5等专业引物设计软件，挺好用的。
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加油。
3楼2012-09-29 15:28:58
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lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-01 20:01:38
review: 金币+2, 谢谢！ 2012-10-08 13:13:55
是用sdna序列就可以了，加A需使用还有加A酶功能的dna扩增酶，有些酶扩增出来是不加A的，另外扩增后你可以直接连接到表达载体上就不需要加A了，另外起始密码和终止密码你一般最好含在里面，因为有些载体是不含有atg启动子和终止密码子的，但大多都是含有的，你带上了也不影响，所以最好带着。
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生物化学与分子生物学
4楼2012-09-29 15:49:21
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review

银虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lidonghong at 2012-09-29 15:49:21
是用sdna序列就可以了，加A需使用还有加A酶功能的dna扩增酶，有些酶扩增出来是不加A的，另外扩增后你可以直接连接到表达载体上就不需要加A了，另外起始密码和终止密码你一般最好含在里面，因为有些载体是不含有atg启 ...

能起个例子吗？非常感谢！
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交流
5楼2012-09-29 16:18:26
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lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by review at 2012-09-29 16:18:26
能起个例子吗？非常感谢！...

恩 酶我还真忘了 你仔细看看酶的使用说明书 上面都有
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生物化学与分子生物学
6楼2012-09-29 16:34:23
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review

银虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lidonghong at 2012-09-29 16:34:23
恩 酶我还真忘了 你仔细看看酶的使用说明书 上面都有...

能举个例子   做个引物设计的例子吗  嘿嘿
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交流
7楼2012-09-29 16:39:19
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lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-10-01 20:02:01
引用回帖:
7楼: Originally posted by review at 2012-09-29 16:39:19
能举个例子   做个引物设计的例子吗  嘿嘿...

引物设计 primer5.0会用吧  比如说你的序列是atg................taa  设计引物的时候，上下游引物必须分别是从atg开始和taa开始，懂这个意思不？这是目的基因全长的克隆表达， 部分序列就不用这样了。
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生物化学与分子生物学
8楼2012-09-29 16:46:43
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123n

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-01 20:02:13
review: 金币+2, 谢 2012-10-08 13:14:10
Taq酶是加A的酶，而pfu不加A！！！   设计引物其实很简单，你要是扩增基因全长的话，就把基因两端的序列完全copy下来就ok，不要少于18bp~~ 绝对能扩增出来！  想要做融合蛋白表达的话，建议 去掉ATG~~~~~
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9楼2012-09-30 09:23:47
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flyde1234

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-01 20:02:26
楼主可以去借一本关于PCR方面的书，看看就知道怎么设计了，其次就是注意，如果用的酶是Taq，pcr后纯化回收可以直接连T载体，如果用的是pfu酶的话，需要加一步A的反应，因为pfu酶不会在pcr产物末端加A
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我相信
10楼2012-09-30 17:52:12
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