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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求高人指导！蛋白浓度不够怎么办？
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草鹿八千留

银虫 (初入文坛)

[求助] 求高人指导！蛋白浓度不够怎么办？

小妹我纯化了一个约18kD的蛋白，准备用NMR解结构，浓度要求达到0.3mM才行，表达量还可以，但是在纯化中试了ph分别为8.0和6.8的buffer，溶解性均不太好，关键是浓缩以后只能到0.1mM就开始沉淀了，纠结啊纠结~~不知各位大侠能不能给点宝贵建议？谢谢了！
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1楼 2012-09-27 14:16:49
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once1015

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
看天: 金币+2, 鼓励回答 2012-09-27 22:50:58
如果不是用于复合物的结构， 可以适当提高盐的浓度。
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2楼2012-09-27 14:43:33
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gelois

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
看天: 金币+3, 鼓励回答 2012-09-27 22:51:06
浓缩出现沉淀，主要还是因为PH不合适的缘故，介意根据蛋白的PI值多试几个PH梯度。同时浓缩的时候，最好补点盐，盐浓度一般要补到0.5M~1M。稍微加一点甘油，保护蛋白，不让浓缩条件太恶劣。
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3楼2012-09-27 14:46:08
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once1015

木虫 (正式写手)
★ ★
看天: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-27 22:51:17
另外需要 用DLS 看一下是否聚集，如果聚集了  你浓度高也不行吧
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4楼2012-09-27 14:46:18
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草鹿八千留

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gelois at 2012-09-27 14:46:08
浓缩出现沉淀，主要还是因为PH不合适的缘故，介意根据蛋白的PI值多试几个PH梯度。同时浓缩的时候，最好补点盐，盐浓度一般要补到0.5M~1M。稍微加一点甘油，保护蛋白，不让浓缩条件太恶劣。

可是我这个要作为NMR采集谱的样品，盐浓度太高的话NMR探头会承受不了，最多承受200mM的盐浓度
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5楼2012-09-27 15:17:22
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草鹿八千留

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by once1015 at 2012-09-27 14:43:33
如果不是用于复合物的结构， 可以适当提高盐的浓度。

是在一个完整结构域后加了一段的融合蛋白，盐浓度已经达到了100mM
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6楼2012-09-27 15:18:12
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草鹿八千留

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by once1015 at 2012-09-27 14:46:18
另外需要 用DLS 看一下是否聚集，如果聚集了  你浓度高也不行吧

用分子筛看出来，没有聚集
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7楼2012-09-27 15:19:56
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gelois

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
看天: 金币+2, 鼓励交流和分享 2012-09-27 22:51:29
引用回帖:
5楼: Originally posted by 草鹿八千留 at 2012-09-27 15:17:22
可是我这个要作为NMR采集谱的样品，盐浓度太高的话NMR探头会承受不了，最多承受200mM的盐浓度...

这样的话，要么你就试几个PH。
再问下，你的蛋白有标签么？His或者GST之类的，如果有的话，可以尝试挂柱富集一下，或许就能把浓度提高上去了。
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8楼2012-09-27 16:13:27
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jiangyhai

金虫 (著名写手)
★ ★
看天: 金币+2, 鼓励交流 常来 2012-09-27 22:51:42
会不会是蛋白不是正确构象呢？
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静心做事。
9楼2012-09-27 20:50:03
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草鹿八千留

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by gelois at 2012-09-27 16:13:27
这样的话，要么你就试几个PH。
再问下，你的蛋白有标签么？His或者GST之类的，如果有的话，可以尝试挂柱富集一下，或许就能把浓度提高上去了。...

有的，是his-tag的，我在纯化的第一步就是挂Ni亲和柱富集的
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10楼2012-09-28 09:52:44
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