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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 提RNA提伤了
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yananhl

银虫 (小有名气)

[交流] 提RNA提伤了

提RNA都快成提RNA工人了，提的次数那是个多啊，可是都要提提伤了，为什么老降解，怎么提都降解，到底是怎么回事，如果说夏天是因为天气热，这个天气怎么也会降解，是个什么情况？我把洗涤RNA的乙醇第一次配成70%，第二次配成73%左右了，不知道脑子怎么了，可能是抽了，老是配错。不知道这些有没有影响。这是我这两天提的RNA图，请大家看看我能不能往下做RACE，我实在没办法了，不知道
到底是个什么原因。今天测了下第一次提的OD值，两个OD260/280和浓度分别是：1.99，785.7ng/ul;2.02,1314ng/ul.我觉得值还是蛮好的。我检测RNA的时候上样量是2ul。用的是普通的检测DNA的器皿，不过新换的电泳缓冲液。

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[ Last edited by yananhl on 2012-9-7 at 10:44 ]
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1楼 2012-09-05 16:37:03
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
yananhl: 金币+1, 恩，好。可能导致这种现象的原因很多吧，就是不知道哪步的原因。 2012-09-06 09:57:33
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-09-06 13:55:59
研究生期间也提了几百个，但是是植物RNA。当时用的管以及枪头都是Axygen的RNase free产品，试剂为TaKaRa的RNAiso，其余仪器以及试剂都是自己处理的。提取这么多次，绝大部分质量不错（电泳结合分光光度计测定OD260/OD280），个人感觉环境和操作都很重要。提RNA最好有个独立的实验室，是在没条件，最好有块独立的RNA操作区；在操作上，操作者的手套口罩等以及实验每步都要考虑如何操作能降低降解的几率。
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12楼2012-09-05 20:40:25
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angel_yy

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
yananhl: 金币+1, 谢谢 2012-09-06 09:56:31
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-09-06 13:56:14
之前提过好多次RNA  人的肝癌组织的，每次的质量都挺好的，说说我的方法，首先要确保所用的移液器和枪头是RNase-free的  最好买进口的，提组织的时候研磨用的研钵和研钵棒要用DEPC水浸泡24h然后高压灭菌，最后烘干，烘干的过程中要用锡箔纸包封好。在研磨前最好把研钵和钵棒放在冰箱中预冷。磨组织的时候要在冰上，并且研钵中要加入trizol和液氮，磨的时候要快。另外就是要戴好手套和口罩。还要注意不要让大家在你身边来回走动，在实验过程中尽量不要对着试验台说话，提RNA的试验台要远离提质粒的试验台。我觉得这些都注意了应该就不会有什么问题了，希望对LZ会有帮助。

[ Last edited by angel_yy on 2012-9-5 at 20:56 ]
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13楼2012-09-05 20:54:46
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gaorongbest

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
9楼: Originally posted by yananhl at 2012-09-05 19:52:27
我是手工提的，什么都是新灭的，用的东西也是全新的，可是就是降解啊，这是我提的图片。降解了啊，不知道是不是因为前面TRIZOL没保护住。我要往下做RACE的，这样的能做RACE吗？
3b/57/1892568_1346845851_728.jpg| ...

谁告诉你这样的结果是讲降解了？条带很明显啊，你们用EB染料还是替代品？应该是替代品吧，结果好着呢
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18楼2012-09-06 13:42:57
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普通回帖

liuguilin

禁言 (文学泰斗)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
以前读书时，有人专门晚上实验室人少时，提rna
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2楼2012-09-05 16:51:19
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xfliu

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我要提500多个呢，现在提了100多个，质量还行
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3楼2012-09-05 16:53:43
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asdkingstar

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
呵呵，同是天涯“沦落”人。深刻体会楼主此时的心情。
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4楼2012-09-05 17:06:35
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xw19880905

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我感觉还行呀，现在一提效果都不错，有时候不只是注意自己环境，还有周边的环境
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5楼2012-09-05 17:52:44
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gaorongbest

新虫 (小有名气)
你是自己手提还是用试剂盒提的？现在的试剂盒提很方便的，不容易降解，其中很大一部分原因是步骤少一些，而且枪头、EP管都经过严格处理；你要是手提的话，尽量在专门提RNA的实验台做，东西用DEPC水处理后高压了再用，手套口罩都佩戴好，各个环节注意到了，才不会总失败的。
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6楼2012-09-05 17:59:49
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gwd0312

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
提ＲＮＡ各个方面都要考虑到，稍微不注意就降解了，细心点会好的！
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7楼2012-09-05 19:07:49
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追梦的人1987

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主是提植物，还是什么的啊
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8楼2012-09-05 19:44:39
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yananhl

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by gaorongbest at 2012-09-05 17:59:49
你是自己手提还是用试剂盒提的？现在的试剂盒提很方便的，不容易降解，其中很大一部分原因是步骤少一些，而且枪头、EP管都经过严格处理；你要是手提的话，尽量在专门提RNA的实验台做，东西用DEPC水处理后高压了再用 ...

我是手工提的，什么都是新灭的，用的东西也是全新的，可是就是降解啊，这是我提的图片。降解了啊，不知道是不是因为前面TRIZOL没保护住。我要往下做RACE的，这样的能做RACE吗？

2012-9-5-4.jpg
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9楼2012-09-05 19:52:27
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yananhl

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 追梦的人1987 at 2012-09-05 19:44:39
楼主是提植物，还是什么的啊

我提的动物组织。
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10楼2012-09-05 19:52:55
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Sweetgirl

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
是不是提的过程中没注意啊！我们一般都是在生物通风柜或超净台里，冰上操作的，戴手套，口罩，枪头离心管都是买的无RNA酶的一次性的那种，尽可能的避免使RNA降解的因素！
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11楼2012-09-05 20:21:36
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doctorteen

新虫 (小有名气)
Bless, good luck!!
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14楼2012-09-05 21:15:32
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yananhl

银虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by angel_yy at 2012-09-05 20:54:46
之前提过好多次RNA  人的肝癌组织的，每次的质量都挺好的，说说我的方法，首先要确保所用的移液器和枪头是RNase-free的  最好买进口的，提组织的时候研磨用的研钵和研钵棒要用DEPC水浸泡24h然后高压灭菌，最后烘干， ...

研磨的时候我们是用液氮直接预冷的，还有DEPC水我处理12小时就。
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15楼2012-09-05 22:01:13
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生化上善若水

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
9楼: Originally posted by yananhl at 2012-09-05 19:52:27
我是手工提的，什么都是新灭的，用的东西也是全新的，可是就是降解啊，这是我提的图片。降解了啊，不知道是不是因为前面TRIZOL没保护住。我要往下做RACE的，这样的能做RACE吗？
3b/57/1892568_1346845851_728.jpg| ...

我也是这种现象，但是测OD值差不多符合。。。有人说是在提取过程中震荡剧烈造成的
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16楼2012-09-06 00:29:23
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yananhl

银虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 生化上善若水 at 2012-09-06 00:29:23
我也是这种现象，但是测OD值差不多符合。。。有人说是在提取过程中震荡剧烈造成的...

怎么震荡剧烈啊，哪步的震荡剧烈啊？
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17楼2012-09-06 09:10:56
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yananhl

银虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by gaorongbest at 2012-09-06 13:42:57
谁告诉你这样的结果是讲降解了？条带很明显啊，你们用EB染料还是替代品？应该是替代品吧，结果好着呢...

用EB染料，不过跑胶的那些没有用DEPC水处理，但是平时提的好的也只有两条带的，不知道是不是因为前面那步的TRIZOL没有保护住，所以今天又重新提了，晚上结果出来了看看什么情况吧。
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19楼2012-09-06 16:17:42
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yananhl

银虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by gaorongbest at 2012-09-06 13:42:57
谁告诉你这样的结果是讲降解了？条带很明显啊，你们用EB染料还是替代品？应该是替代品吧，结果好着呢...

这是我今天又重新提的，这是什么个原因呢？啊啊啊！！！我痛苦啊！！

2012-9-6-2.jpg
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20楼2012-09-06 19:15:41
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windycui

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我的感觉是你整个提rna的过程用时太长了。而且跑rna电泳要新换电泳缓冲液，用depc水配置，有时还要用双氧水清洁电泳槽。说实话以前我们提rna还跑电泳，后期都不跑电泳了，就用超微量分光光度计测浓度和od值。
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21楼2012-09-06 19:51:59
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yangqiya

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我这边因为之前没做过。导师直接出钱让带到研究所给别人做。很幸福
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22楼2012-09-06 20:02:22
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?胛�

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我也提伤了，最近提的几次也总降解，继续泡枪头提取中。。
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23楼2012-09-06 20:48:41
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yananhl

银虫 (小有名气)
引用回帖:
21楼: Originally posted by windycui at 2012-09-06 19:51:59
我的感觉是你整个提rna的过程用时太长了。而且跑rna电泳要新换电泳缓冲液，用depc水配置，有时还要用双氧水清洁电泳槽。说实话以前我们提rna还跑电泳，后期都不跑电泳了，就用超微量分光光度计测浓度和od值。

用depc水配置，有时还要用双氧水清洁电泳槽,这些我没有达到，我直接跑的，但是换的电泳缓冲液。但是原来提的时候有效果很好的呢。但是提RNA的过程用时差不多都是这么长吧。
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24楼2012-09-06 20:59:05
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angel_yy

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
15楼: Originally posted by yananhl at 2012-09-05 22:01:13
研磨的时候我们是用液氮直接预冷的，还有DEPC水我处理12小时就。...

我都是用负80的冰箱预冷的，应该差不多。我觉得提取RNA 细节很重要，开始的时候我提取的样品也会有降解的现象，找了好多次原因 总是找不到，后来莫名其妙的就不降解了 所以建议楼主每次都把细节问题处理好 就没问题了
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25楼2012-09-07 09:43:09
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yananhl

银虫 (小有名气)
引用回帖:
25楼: Originally posted by angel_yy at 2012-09-07 09:43:09
我都是用负80的冰箱预冷的，应该差不多。我觉得提取RNA 细节很重要，开始的时候我提取的样品也会有降解的现象，找了好多次原因 总是找不到，后来莫名其妙的就不降解了 所以建议楼主每次都把细节问题处理好 就没问题 ...

恩恩，可是我都不知道应该注意哪些细节了，所有的细节都注意了已经。对了，提取RNA在超净台里开酒精灯与不开有没有什么很大的区别？有同学不开酒精灯做的，也做的很好。
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26楼2012-09-07 09:47:45
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baby1987

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
结果挺好的，可以用。
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27楼2012-09-07 10:05:52
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博杰冲

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你做反转录么，我觉得rna其实也没那么容易讲解，只要东西对处理好了，是没问题的。
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28楼2012-09-07 10:14:42
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yananhl

银虫 (小有名气)
引用回帖:
22楼: Originally posted by yangqiya at 2012-09-06 20:02:22
我这边因为之前没做过。导师直接出钱让带到研究所给别人做。很幸福

羡慕嫉妒恨啊！
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29楼2012-09-07 11:05:50
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-10 13:48:49
你好！我也还在提RNA，提的效果也不好啊~也纠结呢，
但看你的图，条带清晰，还有3条，我觉得你的提的量应该很多啊！就是降解了吧，因为你的5S带很亮，说明25S和18S降解成5S了吧，所以前两条带比较模糊。
我觉得首先保证材料新鲜，其次你用氯仿去蛋白的那步看有没有必要再重复一次
，最后就是跑电泳，电泳槽之类的要处理干净，不要跑太长时间，一般检测的话跑个15分钟左右也行了吧！
祝你好运，也祝我自己好运！
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30楼2012-09-07 12:00:32
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yananhl

银虫 (小有名气)
引用回帖:
30楼: Originally posted by lmcyjxs at 2012-09-07 12:00:32
你好！我也还在提RNA，提的效果也不好啊~也纠结呢，
但看你的图，条带清晰，还有3条，我觉得你的提的量应该很多啊！就是降解了吧，因为你的5S带很亮，说明25S和18S降解成5S了吧，所以前两条带比较模糊。
我觉得 ...

我也是怀疑降解了，不过我氯仿去除是两次去除的。材料都是在液氮保存的。电泳槽之类的都是都是冲洗过的用电泳液。我跑的是用190V跑了五分钟也没什么问题。我测的OD值也蛮好，不知道是不是测OD值的机子不准。郁闷中！
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31楼2012-09-07 12:19:53
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andyzhengwp

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
看楼主的结果很好啊，可以做race试试
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32楼2012-09-07 12:37:47
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yananhl

银虫 (小有名气)
引用回帖:
32楼: Originally posted by andyzhengwp at 2012-09-07 12:37:47
看楼主的结果很好啊，可以做race试试

好的，我先试下3‘端，不知道到底是什么原因，痛苦中！
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33楼2012-09-07 12:43:44
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angel_yy

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
26楼: Originally posted by yananhl at 2012-09-07 09:47:45
恩恩，可是我都不知道应该注意哪些细节了，所有的细节都注意了已经。对了，提取RNA在超净台里开酒精灯与不开有没有什么很大的区别？有同学不开酒精灯做的，也做的很好。...

我觉得没有什么区别，我提RNA的时候直接在实验台上做的 都没有在超净台 所以也没有酒精灯的
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34楼2012-09-07 16:52:42
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花开极致

银虫 (小有名气)
★ ★
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小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-09-10 13:49:05
我们提RNA的所有枪头还有研钵都是用0.1%的DEPC水泡过，然后最后溶解RNA的也是用1%DEPC水，跑电泳的电泳槽每次都要用H2O2水浸泡半个小时作用，这样其他操作再注意一下，基本上是没问题的。
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35楼2012-09-09 20:46:40
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hch123

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
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yananhl: 金币+5, 真的吗？太好了，我也试着做3’了，今天刚送样，不知道出来结果怎么样？那5‘能做不？听到你这样说我太心慰了。 2012-09-10 19:08:33
lz要求也太高了，这样很好啊！我上次提的还没这好，现在3‘测序结果都发来了。
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36楼2012-09-10 10:44:25
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jackiehyz

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主可以换用试剂盒提呗，我是提的样品太多，提伤了
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37楼2012-09-10 17:57:44
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yananhl

银虫 (小有名气)
引用回帖:
37楼: Originally posted by jackiehyz at 2012-09-10 17:57:44
楼主可以换用试剂盒提呗，我是提的样品太多，提伤了

试剂盒提的量少，做RACE不太好。
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38楼2012-09-10 19:09:03
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hnndpt

铁虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
这个图片中的RNA完全可以用
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39楼2012-09-11 19:48:14
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