| 查看: 1545 | 回复: 4 | |||
[求助]
极纠结！求高手高手高高手！！实时荧光PCR扩增正常，为何跑胶始终弥散？
|
|
如题。已纠结2周多了，这问题。身边能问的高手都问了，还是没法子~~ 求点拨！ 左边marker D2000，前沿为100bp；挨着的俩复孔熔解曲线有俩峰，已确认前者为引物峰，后者当为产物峰，但条带弥散；再往右俩复孔熔解曲线单峰、峰在后，当为产物峰，但弥散；再往右俩复孔熔解曲线单峰、峰在前，引物二聚体；再往右俩复孔熔解曲线单峰、峰在前，但扩增曲线仅有微微抬头、引物二聚体。  [/img]下图为对应的熔解曲线图。 [/img]下图为扩增曲线图。 http:// ![](\"https://muchongimg.xmcimg.com/data/jj3/image3/f6/a8/586686_1346381817_934.jpg#opennewwindow\") 条件及后续问题排查情况如下： 1、第一循环起跳，是因为前面尚做过一次20循环的降落PCR、以增加特异。 2、引物为国际粮农组织推荐SSR引物。 3、电泳条件120v，40min，1.2%琼脂糖凝胶，试过90v，结果一样。上样量2.5uL，试过6uL，结果一样。跑胶之前，扩增产物UV法测过dsDNA浓度，大约200ng/uL。多次重复如此。试过降低引物浓度、可消除引物荧光、但还是弥散。 4、荧光pcr，sybr I（ROX）2倍mix，ABI；7500机器ABI；引物扩增基因250bp左右，GC含量46%50%。Tm值60、62。条件95度20秒、57度40秒、72度1分钟（之前做过20个循环降落PCR66度-57度）。 5、问题排查，做过退火温度梯度及质粒阳性对照。质粒可顺利跑出1000bp条带，mix和水没问题。有引物二聚体条带、降低浓度条带消失、引物没问题。但始终有扩增曲线、跑胶弥散。降低引物浓度后、退火温度梯度66度到55度均试了，扩增结束要么没有、要么引物二聚体、要么弥散、大部分泳道是弥散。 6、模板换成肝组织提取的DNA，情况也如上。 抓狂中…… 求高手高高手指点迷津！！！感激ing！！！  2.JPG  3.JPG [ Last edited by 愚人田蕾 on 2012-8-31 at 12:10 ] |
回复此楼» 猜你喜欢
为什么蛋白质氨基酸测定大家都测17种?
已经有5人回复
-
《灰分记：我与坩埚的“灰烬”之恋》
已经有3人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有265人回复
-
求助 食品检验工（基础知识），中国劳动社会出版社 电子版
已经有5人回复
-
胶体几丁质的结晶度？
已经有0人回复
-
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士
已经有2人回复
-
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线
已经有5人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
着急！RT-PCR扩增效率低，情况很诡异，求助高手帮忙指点
已经有12人回复- 令人纠结的PCR,求高手指点
已经有10人回复
- 旗舰版的W7有50多个进程正常吗，以下进程哪些是对系统无用，可禁用和关闭的？
已经有13人回复
- PCR引物的量如何确定，求助高手指教
已经有11人回复
- 请高手看看我的PCR图片
已经有28人回复
- 我的PCR电泳图怎么这样的啊。。。
已经有11人回复
- PCR高手请进，小女子有事相求，我刚来金币不要嫌少啊，我只有这么多啊，全给你了
已经有20人回复
- 流感病毒RT-PCR，电泳老是跑不出条带~~~纠结！
已经有5人回复
- 求助高手分析DGGE图谱，附PCR图和DGGE图谱
已经有6人回复
- 向RTPCR高手求助，关于RTPCR的空白对照问题
已经有9人回复
- 【求助/交流】PCR没有结果，希望高手指教
已经有29人回复
- 【求助/交流】PCR结果不理想，请教高手。
已经有17人回复
- 【求助/交流】Real time RT-PCR 引物设计问题（高悬赏请高手帮忙）
已经有28人回复
jjg0912
木虫 (正式写手)
- 应助: 17 (小学生)
- 金币: 1882.8
- 红花: 1
- 帖子: 367
- 在线: 113.6小时
- 虫号: 204504
- 注册: 2006-03-02
- 性别: GG
- 专业: 生物信息学
2楼2012-08-31 23:56:18
xyz_su3楼2012-09-04 12:15:28
|
本帖内容被屏蔽 |
4楼2013-10-18 23:47:20
5楼2018-04-15 17:09:12