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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 极纠结！求高手高手高高手！！实时荧光PCR扩增正常，为何跑胶始终弥散？
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愚人田蕾

银虫 (小有名气)

[求助] 极纠结！求高手高手高高手！！实时荧光PCR扩增正常，为何跑胶始终弥散？

如题。已纠结2周多了，这问题。身边能问的高手都问了，还是没法子~~
求点拨！
左边marker D2000，前沿为100bp；挨着的俩复孔熔解曲线有俩峰，已确认前者为引物峰，后者当为产物峰，但条带弥散；再往右俩复孔熔解曲线单峰、峰在后，当为产物峰，但弥散；再往右俩复孔熔解曲线单峰、峰在前，引物二聚体；再往右俩复孔熔解曲线单峰、峰在前，但扩增曲线仅有微微抬头、引物二聚体。
[/img]
下图为对应的熔解曲线图。
[/img]
下图为扩增曲线图。
 http://
条件及后续问题排查情况如下：
1、第一循环起跳，是因为前面尚做过一次20循环的降落PCR、以增加特异。
2、引物为国际粮农组织推荐SSR引物。
3、电泳条件120v，40min，1.2%琼脂糖凝胶，试过90v，结果一样。上样量2.5uL，试过6uL，结果一样。跑胶之前，扩增产物UV法测过dsDNA浓度，大约200ng/uL。多次重复如此。试过降低引物浓度、可消除引物荧光、但还是弥散。
4、荧光pcr，sybr I（ROX）2倍mix，ABI；7500机器ABI；引物扩增基因250bp左右，GC含量46%50%。Tm值60、62。条件95度20秒、57度40秒、72度1分钟（之前做过20个循环降落PCR66度-57度）。
5、问题排查，做过退火温度梯度及质粒阳性对照。质粒可顺利跑出1000bp条带，mix和水没问题。有引物二聚体条带、降低浓度条带消失、引物没问题。但始终有扩增曲线、跑胶弥散。降低引物浓度后、退火温度梯度66度到55度均试了，扩增结束要么没有、要么引物二聚体、要么弥散、大部分泳道是弥散。
6、模板换成肝组织提取的DNA，情况也如上。

抓狂中……

求高手高高手指点迷津！！！感激ing！！！

2.JPG



3.JPG

[ Last edited by 愚人田蕾 on 2012-8-31 at 12:10 ]
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1楼 2012-08-31 11:12:00
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jjg0912

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励积极交流经验 2012-09-01 15:41:24
愚人田蕾: 金币+2, ★有帮助 2012-09-04 12:16:45
从你的定量曲线上看，我感觉你的定量反应并不好。我是两年前做过大量的定量，一般都是第一个峰（引物峰）要低于第二个峰（产物峰）。可看图三并不是这样，其实跑胶的结果也验证了你的怀疑。应该是你的定量模板有问题，别的问题你都考虑到了。建议重新反转录，在做定量前，先做个普通的pcr反应检测模板的效果。
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2楼2012-08-31 23:56:18
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愚人田蕾

银虫 (小有名气)
最后，发现是引物问题，换了引物就好了。具体原因仍然不明。

十分感激楼上的回复！
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

xyz_su
3楼2012-09-04 12:15:28
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wuxin123

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
4楼2013-10-18 23:47:20
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xyz_su

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by 愚人田蕾 at 2012-09-04 12:15:28
最后，发现是引物问题，换了引物就好了。具体原因仍然不明。

十分感激楼上的回复！

你好，我也遇到了PCR后跑胶弥散的情况，大半个月了。没有找到什么问题。请问你的引物是什么问题？求帮助，万分感谢啊
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5楼2018-04-15 17:09:12
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