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极纠结！求高手高手高高手！！实时荧光PCR扩增正常，为何跑胶始终弥散？
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如题。已纠结2周多了，这问题。身边能问的高手都问了，还是没法子~~ 求点拨！ 左边marker D2000，前沿为100bp；挨着的俩复孔熔解曲线有俩峰，已确认前者为引物峰，后者当为产物峰，但条带弥散；再往右俩复孔熔解曲线单峰、峰在后，当为产物峰，但弥散；再往右俩复孔熔解曲线单峰、峰在前，引物二聚体；再往右俩复孔熔解曲线单峰、峰在前，但扩增曲线仅有微微抬头、引物二聚体。  [/img]下图为对应的熔解曲线图。 [/img]下图为扩增曲线图。 http:// ![](\"https://muchongimg.xmcimg.com/data/jj3/image3/f6/a8/586686_1346381817_934.jpg#opennewwindow\") 条件及后续问题排查情况如下： 1、第一循环起跳，是因为前面尚做过一次20循环的降落PCR、以增加特异。 2、引物为国际粮农组织推荐SSR引物。 3、电泳条件120v，40min，1.2%琼脂糖凝胶，试过90v，结果一样。上样量2.5uL，试过6uL，结果一样。跑胶之前，扩增产物UV法测过dsDNA浓度，大约200ng/uL。多次重复如此。试过降低引物浓度、可消除引物荧光、但还是弥散。 4、荧光pcr，sybr I（ROX）2倍mix，ABI；7500机器ABI；引物扩增基因250bp左右，GC含量46%50%。Tm值60、62。条件95度20秒、57度40秒、72度1分钟（之前做过20个循环降落PCR66度-57度）。 5、问题排查，做过退火温度梯度及质粒阳性对照。质粒可顺利跑出1000bp条带，mix和水没问题。有引物二聚体条带、降低浓度条带消失、引物没问题。但始终有扩增曲线、跑胶弥散。降低引物浓度后、退火温度梯度66度到55度均试了，扩增结束要么没有、要么引物二聚体、要么弥散、大部分泳道是弥散。 6、模板换成肝组织提取的DNA，情况也如上。 抓狂中…… 求高手高高手指点迷津！！！感激ing！！！  2.JPG  3.JPG [ Last edited by 愚人田蕾 on 2012-8-31 at 12:10 ] |
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jjg0912
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