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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 5'race 求助，万分感激~~~
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apple712

银虫 (初入文坛)

[求助] 5'race 求助，万分感激~~~

各位大侠好，最近在做5‘race。用的是cloneth的SmartRace kit，引物Tm值在70度附近，操作的步骤完全按照kit的进行：两次PCR过程中，第一次用touchdowm PCR，后产物稀释50倍，作nest PCR，68度退火，72延伸3min，25个cycles；看到有清晰的条带，大小跟我想要的size差不多，回收做连接测序，结果是26S ribosomal RNA gene的部分序列，重新提取RNA并进行检测，cDNA也做了检测，均没有问题。然后做了race，结果得到size差不多的条带，最后测序结果也是一样。奇怪的是所得到的序列中也找不到我做pcr的引物，请问问题出在哪里了？我需要怎样改进我的实验条件？因为是第一次做race，有很多都不懂，请大家指教。谢谢~
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1楼 2012-08-28 20:05:46
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apple712

银虫 (初入文坛)
哎，这两天换了引物又试了各种条件，还是木有结果，悲催呀~
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2楼2012-08-30 19:34:34
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yananhl

银虫 (小有名气)
楼主最近做的怎么样了？我也在纠结中，我的RNA提不好现在是。提的RNA效果只能做3‘的，你提的效果怎么样，用什么方法提的？
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3楼2012-09-18 10:35:03
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apple712

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yananhl at 2012-09-18 10:35:03
楼主最近做的怎么样了？我也在纠结中，我的RNA提不好现在是。提的RNA效果只能做3‘的，你提的效果怎么样，用什么方法提的？

我刚刚做出来了，现在正在扩全长序列。RNA是用kit提的，质量挺好的，但是浓度不是很高，因为我提的那个物种本身就很难提。你也是用clontech的kit做的么，我之前虽然说是在用这个kit，其实是从网上下载人家的protocol，然后自己合成接头引物的，后来换了很多都不行，干脆就买了kit，后来重新做就很快做出来了，所以，还是kit很关键呀~~~
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4楼2012-09-18 16:27:45
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yananhl

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by apple712 at 2012-09-18 16:27:45
我刚刚做出来了，现在正在扩全长序列。RNA是用kit提的，质量挺好的，但是浓度不是很高，因为我提的那个物种本身就很难提。你也是用clontech的kit做的么，我之前虽然说是在用这个kit，其实是从网上下载人家的protoc ...

额，我用的TAKARA的盒子。RNA都提不好，所以很纠结。我提的是动物组织的，RNA老提的不行。所以我现在快郁闷了，都两个月了。。。我准备用基因步移的方法试下了。。
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5楼2012-09-18 16:45:50
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apple712

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by apple712 at 2012-09-18 16:27:45
我刚刚做出来了，现在正在扩全长序列。RNA是用kit提的，质量挺好的，但是浓度不是很高，因为我提的那个物种本身就很难提。你也是用clontech的kit做的么，我之前虽然说是在用这个kit，其实是从网上下载人家的protoc ...

其实我觉得这个主要是RNA质量要好，CDNA要完整，这样之后的就很好做了。有的时候CDNA反转录如果不全的话，kit所带的接头引物根本就没办法起作用~
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6楼2012-09-19 14:05:22
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wushuwei1104

银虫 (小有名气)
★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-19 15:13:29
楼主最近做得怎么样？我也在做5‘RACE，我跟你的情况大致一样，用的试剂盒也是跟你一样，但是我能在我的测序结果中找出做inner PCR的前、后引物，但是经过序列比对，发现跟她的同源其他植物相比5’端缺少20左右bp，现在就不知道为什么会出现这种结果。是本身这种植物这个基因比同源其他植物基因短，还是在做5‘race时，RNA略有降解，但是前后引物都是存在的！   纠结中------
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勤能补拙
7楼2012-09-19 14:44:26
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apple712

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by wushuwei1104 at 2012-09-19 14:44:26
楼主最近做得怎么样？我也在做5‘RACE，我跟你的情况大致一样，用的试剂盒也是跟你一样，但是我能在我的测序结果中找出做inner PCR的前、后引物，但是经过序列比对，发现跟她的同源其他植物相比5’端缺少20左右bp， ...

我觉得你这个属于正常现象，不一定同源植物的基因大小就一样，而且你的只是少了20bp，已经算是相当接近了。我觉得只要扩增的产物中前后引物都有，而且和已知的序列有一部分的重叠序列，同时和同源植物的基因有非常高的相似性，就可以说明所扩出来的是自己想要的东西。
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8楼2012-09-19 16:23:41
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skuy1223

金虫 (小有名气)
内容已删除
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努力！
9楼2012-09-19 16:26:51
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wushuwei1104

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by skuy1223 at 2012-09-19 16:26:51
个人感觉是不是因为你的cDNA不完整造成的？...

我也这么想的，就是可能在提RNA的时候，5‘端可能有些降解，所以师兄又叫我重新做5’RACE。但是我就是想不通前后引物都可以找到，并且同源比对后，发现相似度很高，这又是为什么？
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勤能补拙
10楼2012-09-19 19:40:21
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