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5'race 求助，万分感激~~~
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| 各位大侠好，最近在做5‘race。用的是cloneth的SmartRace kit，引物Tm值在70度附近，操作的步骤完全按照kit的进行：两次PCR过程中，第一次用touchdowm PCR，后产物稀释50倍，作nest PCR，68度退火，72延伸3min，25个cycles；看到有清晰的条带，大小跟我想要的size差不多，回收做连接测序，结果是26S ribosomal RNA gene的部分序列，重新提取RNA并进行检测，cDNA也做了检测，均没有问题。然后做了race，结果得到size差不多的条带，最后测序结果也是一样。奇怪的是所得到的序列中也找不到我做pcr的引物，请问问题出在哪里了？我需要怎样改进我的实验条件？因为是第一次做race，有很多都不懂，请大家指教。谢谢~ |
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yananhl
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