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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 5'race 求助，万分感激~~~
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apple712

银虫 (初入文坛)

[求助] 5'race 求助，万分感激~~~

各位大侠好，最近在做5‘race。用的是cloneth的SmartRace kit，引物Tm值在70度附近，操作的步骤完全按照kit的进行：两次PCR过程中，第一次用touchdowm PCR，后产物稀释50倍，作nest PCR，68度退火，72延伸3min，25个cycles；看到有清晰的条带，大小跟我想要的size差不多，回收做连接测序，结果是26S ribosomal RNA gene的部分序列，重新提取RNA并进行检测，cDNA也做了检测，均没有问题。然后做了race，结果得到size差不多的条带，最后测序结果也是一样。奇怪的是所得到的序列中也找不到我做pcr的引物，请问问题出在哪里了？我需要怎样改进我的实验条件？因为是第一次做race，有很多都不懂，请大家指教。谢谢~
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1楼 2012-08-28 20:05:46
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apple712

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by apple712 at 2012-09-18 16:27:45
我刚刚做出来了，现在正在扩全长序列。RNA是用kit提的，质量挺好的，但是浓度不是很高，因为我提的那个物种本身就很难提。你也是用clontech的kit做的么，我之前虽然说是在用这个kit，其实是从网上下载人家的protoc ...

其实我觉得这个主要是RNA质量要好，CDNA要完整，这样之后的就很好做了。有的时候CDNA反转录如果不全的话，kit所带的接头引物根本就没办法起作用~
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6楼2012-09-19 14:05:22
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apple712

银虫 (初入文坛)
哎，这两天换了引物又试了各种条件，还是木有结果，悲催呀~
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2楼2012-08-30 19:34:34
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yananhl

银虫 (小有名气)
楼主最近做的怎么样了？我也在纠结中，我的RNA提不好现在是。提的RNA效果只能做3‘的，你提的效果怎么样，用什么方法提的？
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3楼2012-09-18 10:35:03
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apple712

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yananhl at 2012-09-18 10:35:03
楼主最近做的怎么样了？我也在纠结中，我的RNA提不好现在是。提的RNA效果只能做3‘的，你提的效果怎么样，用什么方法提的？

我刚刚做出来了，现在正在扩全长序列。RNA是用kit提的，质量挺好的，但是浓度不是很高，因为我提的那个物种本身就很难提。你也是用clontech的kit做的么，我之前虽然说是在用这个kit，其实是从网上下载人家的protocol，然后自己合成接头引物的，后来换了很多都不行，干脆就买了kit，后来重新做就很快做出来了，所以，还是kit很关键呀~~~
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4楼2012-09-18 16:27:45
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