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skuy1223

金虫 (小有名气)

[交流] 酵母表达无目的蛋白

我最近做了一次酵母表达，但是做SDS-PAGE显示没有目的条带。但是电转之后的平板上长了很多菌落。并且挑单克隆之后，做菌液PCR也有目的基因的条带（但是也有杂带）。从条带上看，好像是蛋白降解比较严重。但是除了这个问题，不知道各位大神还能帮我分析下是什么原因吗？
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1楼 2012-08-17 10:50:48
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回帖置顶 ( 共有12个 )

skuy1223

金虫 (小有名气)
希望大家多多帮助啊！！
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2楼2012-08-17 10:51:22
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wt3532

木虫 (著名写手)
★
skuy1223(金币+1): 谢谢参与
移码突变或者阅读框顺序不对
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3楼2012-08-17 12:12:44
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dshlove

木虫 (正式写手)
★
skuy1223(金币+1): 谢谢参与
是不是分泌到胞外了啊？
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4楼2012-08-17 12:47:06
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skuy1223

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wt3532 at 2012-08-17 12:12:44
移码突变或者阅读框顺序不对

阅读框顺序可以确认是正确的，但是是不是移码突变就不知道了。不知道阁下是否有什么方法可以检测移码突变的呢？？
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5楼2012-08-17 15:00:57
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skuy1223

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by dshlove at 2012-08-17 12:47:06
是不是分泌到胞外了啊？

我就是需要蛋白分泌到胞外的，用的载体就是分泌型载体！
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6楼2012-08-17 15:02:44
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starseacow

专家顾问 (职业作家)
★
skuy1223(金币+1): 谢谢参与
我在做mbSUS时遇到过和楼主类似的问题，做western会有莫名其妙的条带出现，但是改进蛋白样品提取方法会有帮助。楼主的蛋白提取是怎么做的？可以考虑一方面缩短酵母培养时间，比如只培养若干小时，使OD600=0.6-0.8，在对数期和平台期获得样品做出来不太一样。另外，有些样品上样前不适合煮沸处理，可以考虑使用DTT常温处理。
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7楼2012-08-17 15:12:42
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dshlove

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by skuy1223 at 2012-08-17 15:02:44
我就是需要蛋白分泌到胞外的，用的载体就是分泌型载体！...

那你取些培养之后的培养基，硫酸铵沉淀，富集一下，再跑胶试试看，看有没有目的条带。
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8楼2012-08-17 16:30:01
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tiandizao

金虫 (小有名气)
★
skuy1223(金币+1): 谢谢参与
表达量低，蛋白浓度达不到，可以浓缩下试试
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9楼2012-08-17 17:20:07
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skuy1223

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by starseacow at 2012-08-17 15:12:42
我在做mbSUS时遇到过和楼主类似的问题，做western会有莫名其妙的条带出现，但是改进蛋白样品提取方法会有帮助。楼主的蛋白提取是怎么做的？可以考虑一方面缩短酵母培养时间，比如只培养若干小时，使OD600=0.6-0.8， ...

我的蛋白是直接分泌表达到胞外的，所以不用提取蛋白。如果只是将菌培养到OD600=0.6-0.8,会不会因为克隆数太少而影响目的蛋白表达量啊？
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10楼2012-08-17 21:05:50
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skuy1223

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by dshlove at 2012-08-17 16:30:01
那你取些培养之后的培养基，硫酸铵沉淀，富集一下，再跑胶试试看，看有没有目的条带。...

我是用脱氧胆酸钠和三氯乙酸进行的蛋白浓缩，跑胶的结果显示条带很模糊，像拖尾，没有明显的条带出现。我怀疑是蛋白降解了，不知阁下知不知道这个蛋白浓缩方法会不会造成蛋白的降解呢？？
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11楼2012-08-17 21:09:09
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skuy1223

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by tiandizao at 2012-08-17 17:20:07
表达量低，蛋白浓度达不到，可以浓缩下试试

可能有这一方面的原因，但是个人感觉好像蛋白有降解，而且在目的蛋白的位置并无条带，甚至连隐隐约约的条带也看不到。不知是不是因为浓度太低，还是根本就没有表达……很纠结啊！！
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12楼2012-08-17 21:12:26
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dshlove

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
skuy1223: 金币+1 2012-08-18 11:04:59
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-18 15:19:37
引用回帖:
11楼: Originally posted by skuy1223 at 2012-08-17 21:09:09
我是用脱氧胆酸钠和三氯乙酸进行的蛋白浓缩，跑胶的结果显示条带很模糊，像拖尾，没有明显的条带出现。我怀疑是蛋白降解了，不知阁下知不知道这个蛋白浓缩方法会不会造成蛋白的降解呢？？...

就我知道的，脱氧胆酸钠是保持蛋白稳定的。三氯乙酸没用过，不好给意见。
而且，蛋白降解无外乎是氧化或者蛋白酶作用。建议你在浓缩的过程加点蛋白酶抑制剂，和一些还原剂。
同时，我觉得只要不是特容易降解的蛋白，你这方法是没问题。
至于有没有表达，建议你将酵母细胞破碎下，做总蛋白的胶看看。
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13楼2012-08-17 21:58:26
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rfengyi

禁虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
18楼2012-08-20 11:01:32
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普通回帖

skuy1223

金虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by dshlove at 2012-08-17 21:58:26
就我知道的，脱氧胆酸钠是保持蛋白稳定的。三氯乙酸没用过，不好给意见。
而且，蛋白降解无外乎是氧化或者蛋白酶作用。建议你在浓缩的过程加点蛋白酶抑制剂，和一些还原剂。
同时，我觉得只要不是特容易降解的蛋 ...

谢谢啦，我会试试！！
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14楼2012-08-18 11:05:16
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xiongyaoling

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我觉得该先将PCR 鉴定了阳性菌落，送去测序，看阅读框是不是正确，我多次遇到这样的情况，不表达。都是阅读框错误～
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15楼2012-08-18 18:14:36
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skuy1223

金虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by xiongyaoling at 2012-08-18 18:14:36
我觉得该先将PCR 鉴定了阳性菌落，送去测序，看阅读框是不是正确，我多次遇到这样的情况，不表达。都是阅读框错误～

我在电转之前，已经将表达载体转入大肠杆菌并测过序了。测序结果也显示正确。难道转入酵母之后还要测序吗？
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16楼2012-08-18 19:44:37
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xiongyaoling

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
16楼: Originally posted by skuy1223 at 2012-08-18 19:44:37
我在电转之前，已经将表达载体转入大肠杆菌并测过序了。测序结果也显示正确。难道转入酵母之后还要测序吗？...

哦这样呀。那就不用再测了。
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17楼2012-08-19 09:23:18
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skuy1223

金虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by rfengyi at 2012-08-20 11:01:32
有些蛋白三氯乙酸沉淀效果可以，不过三氯乙酸偏酸，具有较强腐蚀性，会不会对你的蛋白稳定性，活性不利？最好用硫酸铵沉淀试试，硫酸铵沉淀效果挺不错的，而且比较温和。还有你跑的是小胶还是大胶，小胶的话有可能， ...

有帮助，谢谢回复！
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19楼2012-08-21 09:28:10
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86269480

金虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
13楼: Originally posted by dshlove at 2012-08-17 21:58:26
就我知道的，脱氧胆酸钠是保持蛋白稳定的。三氯乙酸没用过，不好给意见。
而且，蛋白降解无外乎是氧化或者蛋白酶作用。建议你在浓缩的过程加点蛋白酶抑制剂，和一些还原剂。
同时，我觉得只要不是特容易降解的蛋 ...

三氯乙酸浓缩没问题的，一直在用。蛋白降解是酵母分泌表达的最大缺陷，至于氧化还是第一次听说，楼上的能否对酵母降解的应对措施做下详细阐述呢。
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20楼2012-09-02 09:55:57
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