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skuy1223

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[交流] 酵母表达无目的蛋白

我最近做了一次酵母表达，但是做SDS-PAGE显示没有目的条带。但是电转之后的平板上长了很多菌落。并且挑单克隆之后，做菌液PCR也有目的基因的条带（但是也有杂带）。从条带上看，好像是蛋白降解比较严重。但是除了这个问题，不知道各位大神还能帮我分析下是什么原因吗？

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1楼 2012-08-17 10:50:48

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dshlove

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引用回帖:

11楼: Originally posted by skuy1223 at 2012-08-17 21:09:09
我是用脱氧胆酸钠和三氯乙酸进行的蛋白浓缩，跑胶的结果显示条带很模糊，像拖尾，没有明显的条带出现。我怀疑是蛋白降解了，不知阁下知不知道这个蛋白浓缩方法会不会造成蛋白的降解呢？？

...

就我知道的，脱氧胆酸钠是保持蛋白稳定的。三氯乙酸没用过，不好给意见。
而且，蛋白降解无外乎是氧化或者蛋白酶作用。建议你在浓缩的过程加点蛋白酶抑制剂，和一些还原剂。
同时，我觉得只要不是特容易降解的蛋白，你这方法是没问题。
至于有没有表达，建议你将酵母细胞破碎下，做总蛋白的胶看看。