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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 长片段连接问题
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小猫三两只

金虫 (正式写手)

[交流] 长片段连接问题 已有8人参与

最近做的回收产物都连不上,所以双酶切后的产物是直接纯化后连接的,基因三千多,载体六千多,连了好久都没连上,转化后的菌斑菌P都是假的.哪位知道怎么回事啊?
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1楼 2012-08-13 10:04:30
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-14 13:50:52
我之前连接的片段都比你的大，载体也差不多。较大目的片段往载体上连接有一定的困难，对那些只切掉几十个碱基的载体可以不采取切胶回收的方法，而是用乙醇沉淀法回收载体，此方法使目的片段较易连接到载体上。
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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
2楼2012-08-13 10:45:47
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ankang0910

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我去，我和楼主遭遇一样，连片段大小都一样！！！我也连不上！！
敢问乙醇沉淀肿么个做法？？？？
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实验顺利！！
3楼2012-08-13 10:55:13
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ankang0910 at 2012-08-13 10:55:13
我去，我和楼主遭遇一样，连片段大小都一样！！！我也连不上！！
敢问乙醇沉淀肿么个做法？？？？

乙醇沉淀法:产物加2.5倍体积100%酒精（预冷）和1/10倍体积3 M 醋酸钠(pH=5.2,)。-80沉淀30分钟，4度12000rpm离心10 min，再用75%和100%酒精各洗一次就可以了。
不过生工都有纯化试剂盒，10分钟就解决了
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4楼2012-08-13 11:54:02
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 青菜小虫 at 2012-08-13 10:45:47
我之前连接的片段都比你的大，载体也差不多。较大目的片段往载体上连接有一定的困难，对那些只切掉几十个碱基的载体可以不采取切胶回收的方法，而是用乙醇沉淀法回收载体，此方法使目的片段较易连接到载体上。

我也没有加收过，PCR产物及双酶切产物都是直接纯化后做的，但也是连不上。请问你最后是怎么连上的啊
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5楼2012-08-13 11:55:21
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sarah-miao

银虫 (正式写手)
学习下。。。
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6楼2012-08-13 16:07:17
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gl185

铜虫 (正式写手)
★ ★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-14 13:51:10
我觉得是这样子的，我前面带了一个师妹做连接，她也连的是表达载体，前面一直连不上，可是后来连上了。我觉得最大的问题是回收效率的问题，我觉得如果回收的浓度足够高的话，应该连上的几率比较大。还有的就是酶的问题，后来我们也把酶换了，当时改变的就是这两个条件，然后连上了。
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7楼2012-08-14 12:24:11
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sunshine0353

铁杆木虫 (小有名气)
★
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我做过一个4k片段连入12k载体里，16度连了48h，最终连上了。你可以试试。
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8楼2012-08-14 12:52:37
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

★ ★
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小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-15 13:39:56
引用回帖:
5楼: Originally posted by 小猫三两只 at 2012-08-13 11:55:21
我也没有加收过，PCR产物及双酶切产物都是直接纯化后做的，但也是连不上。请问你最后是怎么连上的啊...

我们连接时用的是fermentats 的快速试剂盒，用乙醇沉淀法回收后连接很有效，也很神奇，呵呵我之前大片段一直连接不上，导跟我说采取这种方法我还一直将信将疑，不过实践证明确实有效哈
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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
9楼2012-08-14 14:24:56
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zqx128

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-15 13:40:06
请先排除PCR鉴定的问题：可以摇菌提质粒做个酶切试试，有些看似失败的连接转化其实有时候是PCR鉴定造成的假阴性。
确实需要重新连接转化的时候要算好片段与载体的摩尔比，比值过大过小连接效率都不高。祝好运！
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10楼2012-08-14 14:40:05
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